К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ
Союз Советски к
Соцналнетнческик республик (6l ) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 30. 12.76 (21) 2438514/23-04 с присоединением заявки М(23) Приоритет
Опубликовано 25.11.79. Бюллетень М 43
{51)М. Кл.
С 07 5 7/029
А 61 К 37/48
1ЬЩАаретвбИИВФ K0NN76T
СССР аю двлам нзюбретений я вткрытв1
{5Д) УДК 577.15. .07(088.8) Дата опубликования описания 28,11.79 (72) Авторы изобретения
E. Е. Нуркс, Ю. П. Волков, A. А. Томсон и И. Ю. Стурис (7I) Заявитель
Известен также способ иммобилизации панкреатина путем ковалентного связывания его с аминосиланизированным неорганическим носителей (силохромом), предварительно активярованным глутаровым альдегидом (2) . Согласно известному способу, новитель-силохром силанизируют . )"-аминопропилтриэтоксисиланом и активируют глутаровым альдегидом. Активированный носитель вводят во взаимодействие с раствором очищенного панкреатина в боратном буфере при рН =- 7,0. Недостатком известного способа является низкая активность получаемых препаратов (5-8 ПЕ/ на 1 г сухого носителя), малый выход по связыванию активного белка (5-7 Mr/r сухого носителя) и большая длительность процесса иммобилизации (7 ч).
Белью описываемого способа является павышенне активности нерастворимого комплекса ферментов, увеличение выхода колйчеслза связанного с носителем активного белка и упрогтенио процесса в целом.
Настоящее изобретение относится к способам получения иммобилизованных ферментных препаратов и, в частности к способу получения иммобилизованного препарата протеолитического комплекса5 трипсина, химотрипсина, и карбоксипентидазы (панкреатина).
Этот препарат может найти применение в пищевой, медицинской, микробиологической и парфюмерной промышленности.
В литературе описано большое число способов получения иммобилизованных препаратов ферментов и, в частности, протеолитических ферментов (1) . Обшим не
I5 достатком большинства способов является . то, что в качестве носителей использовались органические материалы, имеющие плохие технологические характеристики и поэтому часто непригодные для использования в промышленности. Значительно более перспективны в качестве носителей неорганические материалы, в частности силохр мы. (54) СПОСОБ ИММОБИЛИЗАБИИ ПРОТЕОЛИТИЧНКОГО
КОМПЛЕКСА - ТРИПСИНА, ХИМОТРИПСИНА
И КАРБОКСИПЕПТИДАЗЫ (ПАНКРЕАТИНА) 3 6989
Цель достигается за счет того, что связывание панкреатина с активированным носителем осуществляют при pH = 8 (достигаемом введением 0,05 Й едкого натра) в среде дистиллированной воды и в присутствии казеина, причем казеин— фермент — носитель берут в весовых отношениях 11-12:2,3-2,5: ХОО.
Описываемый способ иммобилизации панкреатина обеспечивает получение целе- 10 кого продукта с высокой активностью (15-20 ед/г сухого носителя) и увеличение выхода связанного активного белка (13 мг/г сухого носителя). При добавлении казеина в реакционную среду происходит блокировка активных центров ферментов, входящих в состав комплекса. В результате этого связывание катализатора с активированным глутаровым альдегидом носителем осуществляется только через аминогруппы аминокислот, не входящих в состав активных центров ферментов. Добавление казеина и осуществление процесса в среде дистиллированной воды при рН = 8 предотвращает инактивацию ферментов.
Описывается предлагаемый способ иммобилизации протеолитического комплекса— трипсина, химотрипсина и карбоксипентидазы (панкреатина) с высокой удельной активностью целевого прсдукта и высоким выходом количества, связанного с носителем активного белка путем ковалентного связывания ферментов с аминосиланизированным неорганическим носителем (оилохромом), предварительно активированным глутаровым альдегидом при рН = 8,0 в среде дистиллированной воды в присутствии казеина, причем каэеин- . фермент-носитель берут в весовых отно40 шениях 1 1-12:2,3-2,5: 100.
С пос об осуще ствляют: — силохром обогащают аминогруппами с помощью "-аминопропилтриэтоксисилана; — аминосиланизированный силохром активируют глутаровым альдегидом; — активированный носитель в присутствии казеина в дистиллированной воде приводят в контакт с очищенным панкре,атином в весовых отношениях: 11-12 ч. каэеина: 2,3-2,5 ч, фермента: 100 ч, но сителя.
Пример. К 0,1 кг сухого аминосиланизированного силохромма (марки
:СХ-1 или С-80) прибавляют 3. л 2,5%-HÎÃÎ раствора глутарового альдегина, перемешивают в течение 30 мин, с помощью вакуума поры носителя освобождают от воздуха и оставляют на 30-60 мин при комнатной температуре и нормальном атмосферном давлении. Фильтруют и 3 раза промывают дистиллированной водой.
Сушат при.температуре + 80 С в течение 45 ч.
К 0,4 кг влажного (О, 1 кг cyxoro) активированного носителя добавляют
0,6 л 2%-ного раствора казеина в дистиллированной воде, содержащего 2,5 г очищенного панкреатина с активностью
2000 ед/на 1 г, перемешивают в течение 30 мин., с помощью вакуума освобождают поры носителя от воздуха и оставляют на 30 мин при комнатной температуре и нормальном атмосферном давлении (pH средыМ8,0). Фильтруют и 3 раза промывают дистиллированной водой.
Выход 0,4 кг влажного иммобилиэованного панкреатина с активностью 15 —, 20 ед/на 1 г сухого носителя и содержанием активного белка 13 мг/г сухого носителя.
Активность препаратов иммобилизованного препарата панкреатина определя— ют по следующей методика В сосуд (термостатируемый при 35 С) наливают
30 мл 2%-ного раствора казеина по
Гаммерстену на дистиллированной воде (рН вЂ” 8) и помешают 0,5 г влажного иммобилизованного панкреатина. Инкубируют в течение 30 мин при непрерывном перемешивании. Пробы (2.мл) при работающей мешалке берут через каждые
5 мин.
Нерасщепленный белок осаждают с
2 мл 5%-ного раствора трихлоруксусная кислота. Контроль - 2 мп 2%-ного раствора каэеина осаждают 2 мл 5%-ной трихпоруксусной кислоты. Оптическую плотность определяют на спектрофото— метре СФ-16, 3.=280 нм.
Активность иммобилизованного панкреатина определяют по формуле:
ОГ! "Н
А
1,3 время инкубации 0,0082
= ПЕ на 1 r сухого носителя, где ОП вЂ” изменение оптической плотности в пробе в течение времени инкубации:
Н вЂ” объем пробы;
1,3 - тироэиновый эквивалент, 0,0082- вес иммобилизованного панкреатина в 2 мл казеина (conep— жание сухого препарата в
0,5 r влажногn — 0,125 г).
5 698970 б и зоб рете ни я зеин-фермент-носитель берут в весовых отношениях 11-12; 2,3-2,5:100. ли, а
Формула
Способ иммоби з ции протеолитиче ского комплекса — трипсина, химотрипсина и карбоксипептидазы (панкреатина) пу- g тем ковалентного связывания с аминосиланизированным неорганическим носителем — силохромом, активированным глутаровым альдегидом, о т л и ч а ю—
m и и с я тем, что, с целью повышения 10 активности нерастворимого комплекса ферментов, увеличения выхода количества, связанного с носителем активного белка, и упрощения процесса связывание проводят при рН = 8 в среде дистиллированной воды и в присутствии казеина, причем ка-.
Источники информации, принятые во внимание при экспертизе
1. Иммобилизованные ферменты под ред. Березина И. В., Мартинека К . и
Антонова В. К., изц-во МГУ, 1976.
2. Крен N. И., Эрин А. Э„Кивисилла A. К., Лукатевиченс Н. Ю., Кестнер А. И. Гидролиз некоторых белков иммобилизованными протеазами, Х1 Менделлевский съезд по обшей и прикладной химии, рефераты докладов и сообщений„
Биохимия No 6, М., 1975, с. 65 (прототип), Составитель А. Богаров
Редактор E. Виноградова ТехреаО. Андрейко Корректор
Заказ 9919/73 Тираж Ф.Щ Подписное
ЦНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений н открытий
1 13035, Москва, Ж-35, Раушская наб., a. 4/5
Филиал ППП Патент, r. Ужгород, ул. Проектная, 1
