Способ получения противореагинового иммуноглобулина

 

Союз Советскик

Социалистическик

Республик

ОП ИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (733686

Ф .л (61) Дополнительное к авт. свид-ву— (22) Заявлено 10.10.77 (21) 2530827/28-13 с присоединением заявки №вЂ” (23) Приоритет— (51) М. Кл

А 61 К 39/00

Государственный комитет ао делам изобретений и открытий

Опубликовано 15.05.80. Бюллетень № 18

Дата опубликования описания 25.05.80 (53) УДК 615 418 (088.8) М. А. Бабянскас, Г. А. Ермолин, И. М. Ширвинскас, А. А. Сруога и В. П. Зволинскене (72) Авторы изобретения

Институт зоологии и паразитологии АН Литовской ССР (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ

ПРОТИВОРЕАГИНОВОГО ИММУНОГЛОБУЛ ИНА

Изобретение относится к области медицины, а именно иммунологии.

Известен способ получения противореагинового иммуноглобулина путем иммунизации животных, с последуюгцим отделением сыворотки крови, ее очисткой и выделением целевого продукта (1).

Однако известный способ является трудоемким.

Целью изобретения является упрощение способа.

Эта цель достигается тем, что животных иммунизируют суммарной фракцией лимфоцитов, выделенных из миндалин, аденоидов, бронхиальных или мезентериальных лимфатических узлов, а очистку ведут с помощью иммуносорбции суспензией Т-лимфоцитов и сывороточными глобулинами типов G, А, М, Д.

Пример. Приготовление суммарной лимфоцитарной фракции.

Лимфоциты получают из брыжечных лимфоузлов кроликов. Лимфоузлы извлекают, обезжиривают и помещают в предварительно охлажденный раствор Хенкса. Лимфоциты из собранных лимфоузлов выделяли по методике А. Agastom. Лимфоузлы окончательно очищают от жировых и соединительных тканей и измельчают ножницами до пастообразной консистенции в холодной камере при температуре до+4 С. Измельченную массу заливают двумя объемами раствора Хенкса и во избежание повреждения клеток, вместо гомогенизатора встряхивают в колбе 5 мин. Полученную массу фильтруют через двойной слой капроновой ткани. Полученный фильтрат центрифугируют в течение 15 мин в рефрижераторной

1в центрифуге при + 4 С и при 1000 об/мин, так как 2500 об/мин вызывает слипание клеток. Надосадочную жидкость сливают, а из полученных лимфоцитов делают по четыре мазка для контроля.

20 мл клеток смешивают с 30 мл SMEP и добавляют к полученной взвеси 140 мл

95%-ного глицерина для микроскопии с

0,003 мл насыщенного раствора хлористого магния (МдС1в 0,005 М). SMEP готовили путем растворения при нагревании 1,488 r

2в 0,004 М ЭДТА в 65 мл 0,00 М раствора однозамещенного фосфата натрии (NaH аРО ), добавляя сахарозы 0,24 М 82,152 г и 1000 мл дистиллированной воды. Все растворы употребляют в охлажденном до+4 С виде. Таким

733686

Формула изобретения

3 способом подготовленная смесь лимфоцитов хранилась до иммунизации при — 20 С.

Перед иммунизацией лошади SMEP u глицерин трижды смывают физиологическим раствором и центрифугируют.

Противореагиновую антисыворотку (ПРС) получают путем иммунизации лошади. Лошадь иммунизируют 1, 3, 6-й день

30 мл взвеси лимфоцитов (что составляет

4 109 клеток) с 30 мл адьюванта Фрейнде.

На 8, 9. 13, 23 и 25-й день лошадь иммунизируют тем же количеством клеток на физио- 1О логическом растворе, но без адьюванта. На

10-й день после последней иммунизации лошадь обескровливают в стерильные цилиндры на 1000 мл. С целью увеличения ретракции сгустка применяют специальные гири.

Полученную антилимфоцитарную сыворотку

14 (АЛС) инактивируют при 56 С 30 мин.

Очистку полученной антисыворотки проводят с помощью иммуноадсорбции антисыворотки Т-лимфоцитами.

Удаление из антисыворотки антител к другим классам иммуноглобулинов осуществляют с помощью глюторальдегидного иммуносорбента.

Выделение противореагинового антитела (ПРГ) осуществляют из ПРС спиртовым методом. Все процессы выделения глобулинов проводят в условиях, близких к стерильности, в сосудах из нержавеющей стали, в камерах при температуре ниже 0 С, медленно добавляя этиловый спирт в АЛС до

26% при рН 6,8 — 7,2 и температуре — 10 С, выпадает в виде осадка фракция гаммаглобулинов с примесью. Осадок растворяют дистиллированной водой и добавляют спирт до концентрации 13 /o при рН 5,1 и температуре от — 5 до — 6 С. В осадок выпадают бета-глобулины и небольшое количество зт альбумина, альфа-глобулина и гамма-глобулина. В растворе остается очищенный гамма-глобулин. Добавляют спирт до кон4 центрации 26О/о при рН 7 — 7,2 и температуре — 10 С, в осадок выпадают очищенный гамма-глобулин. С целью удаления спирта проводят лиофилизацию.

Из сухой субстанции готовят 5%-ный раствор ПРГ. В качестве растворителя применяют физиологический раствор. Изготовленные растворы подвергают стерилизирующей фильтрации и биологическому, а также химическому контролю (стерильность, апирогенность, безвредность, содержание белка, электрофоретическая однородность) по требованию регламента производства человеческого гамма-глобулина.

Предлагаемый способ позволяет получить эффективную противореагиновую антисыворотку в больших количествах, используя в качестве источника антигена легко доступные источники (гланды, аденоиды, мезентиральные лимфоузлы), и не требует для получения антисыворотки предварительного фракционирования и очистки, является менее трудоемким, Способ получечия противореаги нового иммуноглобулина путем иммунизации животных, с последующим отделением сыворотки крови, ее очисткой и выделением целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа, животных иммунизируют суммарной фракцией лимфоцитов, выделенных из миндалин, аденоидов, бронхиальных или мезентериальных лимфатических узлов, а очистку ведут с помощью иммуносорбции суспензией Т-лимфоцитов и сывороточными глобулинами типов G, А, М, Д.

Источники информации, принять|е во внимание при экспертизе

1. J..1пппцпо1оду, 13, 1967, р. 38.

Редактор E. Хорив а

Заказ 1939/8

Составитель С. Малютина

Техред К. Шуфрнч Корректор М. Внгула

Тираж 673 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж вЂ” 35, Раушская наб., д. 415

Филиал ППП «Патент>, г. Ужгород, ул. Проектная, 4