Способ получения бактериальных аллергенов

 

.8 .097.2.

Союз Советских

Социалистических

Республик

ОП ИСАНЙЕ

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (111791379 (6I ) Дополнительное к авт. свил-ву— (22) Заявлено 15.08.78 (21) 2660855/28-13 (5! )M. К 1.

А 61 К 39/35 с присоединением заявки №вЂ”

Государственный комитет (23) Приоритет—

f10 делам изобретений и открытий (53) УДК4 576.8 .097.2. (088.8) Опубликовано 30. 12.80. Бюллетень № 48

Дата опубликования описания 31. 12.80

A. Н. Маянский, И. Е. Алатырцева, Б. А. Молотилов, И. B. Молчанова и В. М. Лукашков (72) Авторы изобретения

Казанский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии (7l ) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БАКТЕРИАЛЬНЫХ

АЛЛЕРГЕНОВ

Изобретение относится к медицинской промышленности и касается получения бактериальных аллергенов, Известен способ получения бактериальных аллергенов путем выращивания микроорганизмов в жидкой питательной среде с последующим отделением биомассы, выделением целевого продукта путем осаждения из надосадочной жидкости, растворением осадка, его очисткой и стерилизацией (1).

Однако известный способ не обеспечивает высокой специфичности аллергенов. (Содержание белка в 1 диагностической дозе аллергена: для золотистого стафило 15 кокка 60-130, кишечной палочки 35-75 стрептококка группы А 15-30, протея мирабилис 4-12 мг).

1Лель изобретения — повышение специфичности аллергенов.

Достигается это тем, что растворенный осадок очищают с помощью гель-хроматографии и выделяют фракции с мрлекулярным весом выше 30000.

Способ осуществляют следующим образом.

Приготавливают маточные культуры.

Йля изготовления используют сухие штаммы культур соответствующего вида. Штаммы высевают раздельно в пробирки с питательным бульоном и выращивают при

37 С в течение 18-20 ч, после чего пересевают на мясо-пептовый агар. >

После двух пассажей делают высев на серийную питательную среду, состоящую из смеси бульонов Мартена и Хоттингера с добавлением 0,2% глюкозы и рН

7,2-7,4Бульонную культуру через 1820ч выращивания проверяют на чистоту путем микроскопии.

Питательные среды, разлитые в матрацы по 50мл, засевают 18-20 часовыми бульонными культурами. Плотность посева

100-150млн микробных тел на 1мл сре» ды. Матрацы хорошо перемешивают и поо мещают в термостат при +36-1-37 С в о наклонном положении под углом 10-20

Через 5-6 суток культуру из каждого

7813 матраца проверяют на чистоту путем микроскопирования, затем центрифугируют в течение 1ч при 3000 об/мин. Супернатанты иэ культуры разных штаммов одного вида объединяют, © 5

Супернатант, охлаждаемый до +4-+7 осаждают 98%-ной уксусной кислотой.при рН 4,0-4,2. После выдерживания подкисленного супернатанта при +4-+7 В в течение 24-48 ч, осадок отделяют цвнтрифугированием при 5000-6000 об/мин в течение 15 мин, Надосадочную жидкость осторожно сливают, Осадок дважо ды отмывают охлажденным до +4-+7 С физиологическим раствором с pH=4,04,2, за ем растворяют боратнобуферным раствором с pH=7,0-7,2, который добавляют из расчета 1/100-1/500 относительно объема осажденного супернатанта доводят рН до 7,5-7,8 добавлением 30%-ного раствора

ЙаОН и оставляют в холодильнике при

+4-+7 С на 24-48 ч.эатем препарат подвергают гель-хроматографии на колонке с сефалексом Г-50 или молселектом.

Фракция, очищенная от иммунологически инертного балласта, элюируется под конт« ролем спектрофотометрии при 280 нм в виде первого пика, соответствующего свободному объему геля, Препарат стерио лиэуют автоклавированием при 110 С в течение 30 мин.

После проверки стерильности и безвредности препарат разводят на кожные дозы по содержанию единиц белкового азота (0,1 мг белкового азота соответствует

10,000 P ЙИ).

Содержание P NH в 2 мл и степень специфической активности для каждого вида аллергена регламентированы действующими ТУ. Специфическую активность разведенного аллергена проверяют методом внутрикожных проб на больных с инфекционно-аллергическими заболеваниями, йри которых возможна сенсибилаза» ция к данному виду микроорганизмов.

П р и м в р. Получение аллергена кишечной палочки. В качестве исходного продукта для получения очищенного аллергена кише Зной цалочки используют концентрированный маточный аллерген двух штаммов кишечной палочки (штаммы

%% 2-ЧП и 1-6 .), который является основой препарата диагностического аллергена кишечной палочки, Культуры выращивают б суток при +37 С на жидкой питао

И тельной среде, состоящей иэ одной части бульона Мартена и двух частей буьлона

Хоттингера, Бульонную культуру подвергают центрифугированию в течение 1 ч

79 ф при 3000 o6/мин, Супернатант осаждают

98%-ной уксусной кислотой при рН - 4,0

4,2, Осадок отделяют центрифугированием на холоде в течение 15 мин при 5000 об/мин. Надосадочную жидкость сливают, а осадок отмывают охлажденным до +4о

+7 С физиологическим раствором с рН =

= 4,0-4,2, а затем растворяют баратнобуферным раствором с рН=7,0-7,2, из расчета 1/100 исходного объема супернатанта. После тщательного перемешивания рН доводят до 7,0-7,2 добавлением

30%-ного раствора М аОН.

Препарат подвергают хроматографии на колонке с гелем сефадекса Г-50. Свободный объем колонки предварительно определяют при помощи элюирования высокомолекулярного соединения (голубой декстран Т-2000), На колонку размером

25х800 мм наносят 10мл препарата и проводят элюирование боратно-буферным раствором при рН = 7,2. Пробы элюата объемом 5-6 мл объединяют под контролем спектрофотометрии при 280 нм. о

Йля колонки с гелем сефадекса 25х х 800 мм свободный объем составляет

ИO-ИИ мл. Фракцию 1 стерилиэуют автоклавированием при 110 С в течение 30 мин. Препарат проверяют известными способами на стерильность и безвредность определяют содержание единиц белкового азота. Стандартизируют препарат в кож ных диагностических дозах, За 1 диагностическую дозу принимают разведение аллергена с наименьшим содержанием (400 PN И в 1 мл) белкового азота, вызвавшее положительные внутрикожные реакции у 40-60% больных с инфекционно-аллергическими заболеваниями, в патогенезе которых имеет значение сенсибилизация к кишечной палочке (хронические заболевания желудочно-кишечного тракта с аллергическим компонентом).

С фракцией 1 выходит около 50% белка, содержащегося: в цельном препарате.

Основу фракции 1 составляют белковые компоненты с молекулярным. весом более

30,000 (80-85%), связанные с неболь- . шим количеством углеводов (5-8%), нуклеиновых кислот (6-12%) и липидов (О, 5 1%), Практически все антигены элюировались в составе фракции 1 (мол.вес

30.000), последующие фракции (мол.вес

30.000) были иммунохимически инертныфракция III, или слабо активны — фракция II.

При внутрикожном тестировании на морских свинках, сенсибилиэированных к цельСоставитель С. Малютина

Редактор Т. Кузьмина Техред Н.Бабурка Корректор В. сутяга

Заказ 9159/6 Тираж 673 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент, г.Ужгород, ул. Проектная, 4

S 79 ному аллергену кишечной палочки, почти вся активность была связана с фракцией

Используя предлагаемый способ были получены очищенные раствоимые аллергены золотистого стафилококка, стрептококка группы А, кишечной палочки и протея мирабилис.

При испытании этих аллергенов в клинических условиях установлена их высокая специфическая активность при значительно меньшем, по сравнению с коммер . ческими препаратами, содержаний белка в 1 кожной дозе препарата. Для аллергена золотистого стафилококка содержание белка в 1 кожной дозе снижено в 4 раза, для аллергена стрептокок. .ка группы А в 6 раз, для аллергена кишечной палочки и для аллергена протея мирабилис - в 2 раза.

Предлагаемый способ позволяет получать более стандартные препараты бакте1379 6 риальных аллергенов, используемых в практике здравоохранения.

Формула изобретения

Способ получения бактериальных аллергенов путем выращивания микроорга: низмов в жидкой питательной среде с последующим отделением биомассы, выдьлением целевого продукта путем осажде1О ния из надосадочной жидкости, растворением осадка, его очисткой и стерилизацией, отличающийся тем, что, с целью повышения специфичности аллергенов, растворенный осадок с помощью гельхроматографии и выделяют фракции с молекулярным весом выше

ЗОООО, Источники информации, принятые во внимание при эксперитзе

1. Справочник по применению бактерийных и вирусных препаратов, М.„1975„ с. 56-57.