Способ количественного определенияцеллюлозы и целлюлозных мйкросрганизмов

 

Союз Советских

Социалистических

Республик

ОП ИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (1ц826239

* ./ (61) Дополнительное к авт. свнд-ву— (22) Заявлено14.08.78 р1) 2663763/23-04 (51)M. Кл.

С 01 Й 33/46 с присоединением заявки М тоеударетееннмй комитет

СССР (23) Прнорнтет

Опубликована(30.04.81. Бюллетень Ле16 по делам изобретений н открытий (5З) УДК 543.432 (088.8) Дата опубликования описания 05.05.81, В. П. Гаврнпов, А. А Туманов и E. А. орость1Лйа „ -, I с. (.,:.1 i

Ф

Е / с \ °

Научно-исследовательский институт химии при .Горьковскоя I ордена Трудового Красного Знамени Ьщ:, д6р лэерном: -" / университете им. Н. И. Лобачевского --, ".: /

C (72) Авторы изобретения (71) Заявитель (54) СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ

ЦЕЛЛЮЛОЗЫ И ЦЕЛЛЮЛОЗНЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ

Изобретение относится к аналитической химии, а именно к способам количественного определения целлюлозы и целлюлозных м икр оорган измов.

Известен способ количественного определения целлюлозы, основанный на обработке анализируемой пробы смесью уксус-, ной, .концентрированной азотной и трихлоруксусной кислот при кипячении с последую-. щим определением целлюлозы весовым методом (lg, Ю

Недостатки способа — длительность и сложность обработки, низкая избирательность определения.

Наиболее близким к предлагаемому яв)5 ляется способ количественного определения целлюлозы и целлюлозных микроорганизмов путем обработки анализируемой пробы микроорганизмом SOY сеттс Юттт с800п с0901% при 27 С и рН среды 7,0 с последующей

0 обработкой полученной смеси реактивом

Шамоди-Нельсона и спекгрофогометрированием .полученного при этом окрашенного раствора 123.

Недостатки способа — длительность определения (5сут) и низкая чувствительность (3 мгlмл).

Пель изобретения - повышение чувст вительности и сокращение времени определения.

Поставленная цель достигается способом количественного определения целлюлозы и целлюлоэньтх микроорганизмов путем обработки анализируемой пробы микроорганизмом SN аттфиттт сеИпйояотп с последующей обработкой полученной смеси реактивом Шамоди-Нельсона и спектрофотометрированием полученного окрашенного раствора, при етом обработку-осуществляют фильтратом Вогаттц ещ сеИЖоетцт при рН среды 3-5 и температуре 40-45 С.

Построение калибровочного графика целлюлозы.

В пробирку помещают порошок целлюлозы (О,1-225 мг) и заливают 10 мл фильтрата культуральной жидкости бактерии

Вот ати1 1отп СВИВВовц ттт, выращенной на среде Хетчинсона при 27оС и ингенсивной аэрации, и содержащей в 1 мл 1 млрд клеток. Смесь энергично перемешивают, доводят рН до 4.,0 путем добавления 0,05 мл (1 капля) концентрированной соляной кислоты и термостатируют

Э 5 при 40 С в течение 1 ч. Отбирают 1 мл смеси и определяют образовавшиеся в результате ферментативного гидролиза редуцируюшие сахара по методике ШамодиНельсона.

Методика Шамоди-Нельсона.

Метод основан на реакции окисления моносахаридов под действием солей двухвалентной меди в щелочной среде Си +

+ В

+ восстановленный сахар =Си + окисленный сахар, В свою очередь, закись меди восстанавливает арсено-молибдат с образованием молибденовой сини. По поглощению, полученного окрашенного раствора судят о кон-20 центрации редуцирующих сахаров.

Реактивы.

1. Раствор Шамоди.

Раствор 1-12 r тартрата натрия 24 r

Йа СС (безводного), 16 r 8 аНСО и 25

14,4г И а 50 растворяют в воде и доводят до 800 мл.

Раствор 2,4 г Си90 . 5Н О и

3,6 г К а 50, растворяют в 200 мл.

Перед употреблением соединяют четыре З0 обьема раствора 1 и один обьем раство ра 2, Раствор не должен облучаться солнечным светом.

2, Реактив Нельсона.

25 г. молибдата аммония растворяют в

450 мл воды, добавляют 21 мл концентрированной серной кислоты и 3 г мышьяковокислого натрия в 25 мл дистиллиро40 ванной воды, соединение доводят до 500 мл.

Раствор выдерживают 48 ч при 37 С.

Определение осуществляют следующим образом, В специальные пробирки из термостой45 кого стекла на 10 мл вносят 1 мл испытуемого раствора и добавляют 1 мл раствора Шамоди, Пробирки помещают в кипящую водяную баню на 15 мин, затем охлаждают и добавляют 1 мл реактива

Нельсона, доводят дистиллированной водой

50 до метки, закрывают пробкой и снова,перемешивают, Растворы колориметрируют на спектрофотометре СФ-16 при г =508 им в кювете с длиной грани 5. мл. Раствором

55 сравнения служит дистиллированная вода.

Данные для построения калибровочной кривой определения глюкозы приведены в табл. 1 (0 =5).

Таблица 1

Содержание глюкозы, мг/мл

0,18

0,47

0,69

0,79

0,1

0,25

0,35

Результаты для построения калибровочного графика определения целлюлозы представлены в табл. 2.

Таблица 2

0,1

0,14

0,22

0,30

Пример 1. В пробирку помещают

50 мг порошка целлюлозы и заливают

10 мл фильтрата культуральной жидкости бактерии огачц;1ого сеИоЮоян е, выращенной на среде Хетчинсона при 27оС и интенсивной аэрации, и содержащей в 1 мл

1 млрд клеток (концентрация целлюлозы

5 мг/мл). Смесь энергично встряхивают, доводят рН до 4,0 путем добавления

1 капли (0,05 мл) концентрированной соляной кислоты и термостатируют при 40 С о в течение 1 ч. Отбирают 1 мл смеси и определяют образовавшиеся в результате ферментативного гидролиза редуцирующие сахара методом Шамоди-Нельсона. Нахо дят по ранее построенному калибровочному графику, что в результате ферментативного гидролиза образовалось 0,1 мг/мл глюкозы. Известно (табл.2), что данное количество редуцирующих сахаров и соответствует содержанию целлюлозы в анализируемой смеси 5 мг/мл.

Пример 2. Для определения целлюлозы используют фильтрат культуральной жидкости целлюлозной бактерии богащфою СеЫоСобоп (ВКМ В 644), выращенной при 27 С и интенсивности о аэрации на среде Хетчинсона(К НРО, 1г, СаСВ 0,1 г, W g 0,3 г, НаС6

0,1 г, FeCLy 0,01 r, Nally 2,5 г, целлюлоза 5 мг/мл, вода 1000 мл), и содержащей в 1 мл 1 млрд клеток.

Таблица 5

1 рН среды

1Пределы обнаружения, - мг/мл

3,Э

0,1 - 8,0

0,05 — 16,2

0,01 — 22,5

0,03 - 20,5 — 1 1!

Беллюлоза, мг/мл

3,5

Найдено

Введено

4,0

4,5 0,002 го

+ 0,015

0,01

0,01

5,0

О,l

0,l

1,0 «+ 0,10

1,0

+ 0,25

+ +03О

5,0

5,0

10,0

10,0

15,0 «+ 0,45

20,0 + 1,00

15,0

20,0

22,5

+1,13N

22,5

Таблица 4 40

Предел обнаружения, мг/мл.

Температура, С

О, 1-15,0 45

О, 1-18, О

0,0 1-22,5

0,01«22,0

О, 1-17,0

50

5 826

Анализируемую пробу заливают 10 мл фильтрата, доводят pH ao 4,0 и термостатируют при 40"С в течение 1 ч. Образовавшиеся редуцирующие сахара определяют по методике Шамоди-Нельсона и по предварительно построенному калибровочному графику зависимости редуцирующей способности от концентрации целлюлозы. При удельной активности целлюлозы в фильтрате 8,5 ф.е. на 1 мг белка можно оп- 1р ределить 0,01-22,5 мг/мл целлюлозы.

Результаты определения целлюлозы приведены в табл. 3 (n =5; d =0,95).

Таблица 3

Пример 3. Способ осуществляют аналогично примеру 1, но термостатирование проводят при 30-50 С. о

Зависимость пределов обнаружения целлюлозы от температуры проведения ферментативного гидролиэа представлена вт габл. 4.

Из табл. 4 следует, что интервал температур 40-45 С является оптимальным при проведении ферментативного гидролиза, так как обеспечивает максимальный диапазон определяемых содержаний.

239 6

Пример 4. Способ осуществляют аналогично примеру 1, но при проведении ферментативного гидролиза рН среды соответствует 3,0-5,0, Зависимость пределов обнаружения целлюлозы от рН среды при проведении ферментативного гидролиза представлена в табл, 5.

Из табл. 5 видно, что рН среды 4,0 при проведении ферментативного гидролиза обеспечивает максимальный диапазон определяемых содержаний.

Предлагаемый способ позволяет сократить продолжительность определения целлюлозы и целлюлозных микроорганизмов (с 5 сут до 2 ч при условии постоянного культивирования микроорганизмов; с

5 сут до 2 сут при условии периодическо го культивирования микроорганизмов; обеспечивает достаточную чувствительность (0,01 мг/мл по сравнению с 3 мг)мл в известном способе) и специфичность определения целлюлозы и целлюлозных микроорганизмов в среде, содержащей другие углеводы и окисляющие их микроорганизмы.

Формула изобретения

Способ количественного определения целлюлозы и целлюлозных микроорганизмов путем обработки анализируемой пробы микроорганизмом Go> anqðU тв СеИобобОгп с последующей обработкой полученной смеси реактивом Шамоди-Нельсона и спектрофотометрированием полученного окрашенно го раствора, î т л и ч а ю шийся тем, что, с целью повышении чувствительности и сокращения времени определения, обработку осуществляют фильтра том богсхпфиа ce88uCosvm при рН среды 3-5 и температуре 40-45 С.

826239

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Бауэр К. Анализ органических соединений. M., 1953, с. 357.

2. Туманов А. А. и др. Биохимическая индикация полисахаридов. Цешполоза. Труды по химии и химической технологии, вып. 2, 1975, с. 80-85 (прототип).

Составитель Л. Сопоменцева

Редактор Е. Йичинская Техред A. Савка . - Корректор М. Йемчик

««««» e «а««««« «« ВЭ «Ю« «Ф

Заказ 2512/67 Тираж 907 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035;- Москва, Х35,- Раушская иаб., д. 4/5

Филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4