Способ определения повреждений бактериальной клети

 

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИ ЕПЛЬСТВУ

Союз Советских

Социалистических

Республик нщ857262

Ф%3 (61) Дополнительное н авт. свид-ву (51}М, Кл. (22) Заявлено 231079 (21) 2854661/28-13 с присоединением заявки ¹вЂ”

С 12 N 1/06

Государственный комитет

СССР ло делам изобретений и открытий (23) Приоритет

Опубликовано 230881. Бюллетень ¹ 31

Дата опубликования описания 2 30881 (53} УДН 576.8 (088. 8) а ф

Ф (72) Авторы изобретения

N.B. Камышенцев, E.È. Бабкин, О.Ю. Яшина и С.С. Автушенко

I.c

Всесоюзный научно- исследовательский институт особо чистых биопрепаратов (71) Заявитель (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПОВРЕЛ(ДЕНИЯ

БАКТЕРИАЛЬНОЙ КЛЕТКИ

Изобретение относится к микробиологии, а именно определению повреждений оболочки бактериальной клетки.

Известен способ определения повреждений бактериальной клетки путем проведения биохимических исследований до и после воздействия повреждающего агента 111.

f0

Однако известный способ не обеспечивает высокой точности.

Цель изобретения - повышение точности способа.

Эта цель достигается тем, что способ определения повреждения бактериальной клетки осуществляют путем проведения биохимических исследований до и после воздействия повреждаю« щего агента, из исследуемых бактерий 2О получают протопласты, определяют в них и в исходной клеточной суспенэии активность аденоэинтрифосфатов, воздействуют на обе популяции повреждающим агентом, повторно определяют в них активность аденозинтрифосфата и при увеличении их активности по сравнению с исходной в протопластах определяют повреждение бактериальной мембраны, а прн увеличении ее в бактериальных клетках определяют повреждение стенки бактерий.

Способ осуществляют следующим образом.

Бактериальную культуру клеток, подозреваемых на наличие в них микроповреждений (опытная) и бактериальную культуру таких же клеток, не подвергавшихся какому-либо воздействию (контрольная), разделяют обе на две части, одну иэ которых перерабатывают в протопласты. Составляют ферментные пробы, соответственно содержащие в одном случае только клетки, а в другом протопласты, а кроме того в обоих пробах аденоэинтрифосфат (АТФ) и ионы Mg .Ôåðìåíòные пробы инкубируют, останавливают ферментную реакцию добавлением в пробы хлорной кислоты, центрифугируют пробы и в надосадочной жидкости определяют содержание неорганического фосфата (P) любым известным методом, например, по Амесу и Дюбину. Определяют также по методу Лоури концентрацию белка, вносимого в ферментные пробы в форме клеток и протопластов.

Возрастание величин активности

АТФ-аэы в клетках опытных проб при равнении их со значением активности

857262

Повреждающие факторы

Известный способ

Выживаемость (81, млрд/мп

Предлагаемый способ

Клеточная мемб рана

Клеточная стенка

Оболочка (недифференц) До После воз воз» дей- действия ствия

После До возвоздейст действия вия

После воздей ствия

До воздей ствия

После воздействия

До воз действия

Замо аживаниеотта Гвание.

1) 400 С/мин до -196îС (n=12) 74+ 40+

5 7 3,2

1,29+

0,08

0 26+

0,04

1, 16+

0,07

2) 1 С/мин, до

-20 С (n=12) 0

74+ 34+

S,7 3,4

2,43+

0,12

1,25+

0,03

1,87+

ОР21

АТФ-азы в контрольной пробе считают следствием наличия микроповреждений в клеточной стенке, а аналогичные сравнения, проведенные для протопластов — следствием повреждения клеточной мембраны.

Степень повреждения бактериальной оболочки выражают в единицах повреждения (ЕП).

За 1 ЕП принимают повреждение оболочки бактерий, которое обуславли. ° вает увеличение активности АТФ-азы на 100%. Активность ATC-азы рассчитывают в мкмоль Р/мг белка в 1 ч.

Для нативной культуры (не подверг. нутой воздействию повреждающего

Фактора) активность АТФ-азы и наличие микроповреждений в клетках и протопластах считают равными соответственно 100% и 0 (нуль) ЕП.

Определение степени целостности оболочки микроорганизмов проводят на примере культуры бактерий E.со1

М-17.

Для этого 0,5 мл плотноотцентрифугированных клеток бактерий дважды пРомывают 10 мм тряс-НС(бУфеРом (РН = 7,8} посредством суспендирования клеток в 10 мл буфера и осаждения центрифугированием.

Осадок клеток суспендируют в 11 мл буфера 11: 100 мм трис-НСС, РН 7,8 и 20Ъ сахаровы и делят на две части, Из одной части объемом 10 мл выделяют протопласты посредством прибавления к ней при постоянном помешивании раствора лизоцима (до конечной концент рации 150 Ng/мл, смесь инкубируют при 37 С в течение 15 мин и смешивают с 1 М раствором ЭДТА в соотношении 10:1 Ч/ч, и инкубируют при том же режиме в течение 15 мин.

Процесс завершают дробным центри- 40 фугированием: смесь центрифугируют при 3500 у в течение 10 мин, 1/2 часть верхнего слоя отсасывают и снова центрифугируют при 400 О в течение 20 мин.

Осадок, содержащий 90-100% протопластов, отделяют от надосадочной жидкости и суспендируют в буфере 11.

Составляют ферментные пробы из:

1,2 мл 1,25 мл MgC(!@, 0,2 мл суспензии клеток (протопластов) и 0,6 мл раствора АТФ 2,5 m M (рн 6,9-. 7,8).

Параллельно составляют и одну контрольную пробу: те же ингредиенты, что и в ферментных, но только вместо клеток (протопластов) - 0,2 мл буфера 11. Пробы инкубируют 30 мин при

37 С и отрабатывают 0,3 мл 20%-ной о хлорной кислотой, центрифугируют при 70009- в течение 5 мин,надосадочную жидкость отсасывают и анализируют на количественное содержание в ней неорганического фосфата (P) методом Амеса и Дюбина в модификации:

1 мл надосадочной жидкости смешивают с 2,0 мл свежеприготовленной смеси (1 часть 10%-ного раствора аскорбиновой кислоты и 6 ч. 0,42 Ъ-ного раствора молибдата аммония в 1 И растворе серной кислоты), Пробы инкубируют 30 мин при 37 С; охлаждают в ледяной бане и анализируют íà оптическую плотность (против контрольной пробы) при 660 нм.

Сравнительные результаты известного и предлагаемого способа представлены в таблице.

Характеристика величины повреждений оболочки бактерий {клеточной стенки и клеточной мембраны) различными повреждающими факторами осуществлена предлагаемым Способом и известным, данные в единицах повреждения (ЕП) 857262

Продолжение таблицы!

Повреждающие факторы

Предлагаемый способ

Известный спо- Выживаемость соб 8 млрд/мл

Клеточная стенка Клеточная мемб рана Оболочка ,(недифференц) До После воз — воз— дейст- дейвия ствия

До воздей- После До воз После ствия воздейст действия воздей вия ствия

После воздействия

До воз действия

Химическое вещество

Мол.вес.266, гидрофобной природы (n=3), мг Ъ

0,04

0 Неопр. 93 11,8

0 То же 93 2,9

0 †- 93 0,32

1,20

0,15

0,39

2,48

1,00

0,62

2,51

5 00

Вода (дистиллированная) (культ:вода =

1:3 Ч/Ч; комн. 0 (п=1), время контакта 24 ч).

0 Неопр. 36 34

0,50

1 09 повреждений после воздействий не обнаружено.

Формула изобретения

Составитель С. Малютина

Редактор В. Лазаренко Техред Т.Маточка Корректор М. Демчик

Тираж 528 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по.делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Заказ 7149/43

Филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Как видно из представленной таблицы, экспериментальные данные по контролю целостности оболоч к бактерий, полученные с помощью предлагаемого способа, оказались более точными, информативными и объективными по сравнению с данными, полученными с помощью известного способа.

Предлагаемый способ обеспечивает более высокую точность и информативность.

Способ определения повреждения бактериальной клетки путем проведения биохимических исследований до и после воздействия повреждающего а.ента, о тлич а ющий с я тем, что, с целью повышения точности

Я способа, из исследуемых бактерий получают протопласты, определяют в них и в исходной клеточной суспензии активность аденозинтрифосфатов, воздействуют на обе популяции повреж40 дающим агентом, повторно определяют в них активность аденоэинтрифосфатов и при увеличении их активности по сравнению с исходной в протопластах определяют повреждение бактериаль.ной мембраны, а при увеличении ее

45 в бактериальных клетках определяют повреждение стенки бактерий.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Strange RE. ЗпЖсед enzyme

5О synthesis inagreons suspension of

stored Stationary phase. Aегоbacter

aегоgenes Nature. )ondon, 1961, N. 191, рр, 1242- 1273.