Способ получения l-треонина

 

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-ТРЕОНИНА, предусматривающий проведение операций приготовления посевного материала путем выращивания процудентов треонинабактерии Escherchia coli в посевной питательной среде, введения посевного материала в ферментационную питательную среду, содержащую источники углерода , азота и минеральные соли, добавления гидролизата белоксодержащего субстрата и последующую ферментацию в глубинных условиях, отличающийся тем, что, с целью расширения сырьевой базы, а также удешевлен ния способа, в качестве продуцентов треонина используют штамм Escherchia coll (ВНИИгенетика - 472Т), при этом выращивание продуцентов ведут в жидкой посевной среде, а добавление гидролизата белоксодержащего субстрата осуществляют непосредственно в посевс Ф ную питательную среду.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

А1 (19) (И) Щ)5 С 12 P 13/08 .

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И OTHPbITHRM

ПРИ П.(НТ СССР (21) 2969838/28-13 (22) 06.08.80 (46) 23,08.90. Бюл. № 31 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции микроорганизмов (72) В.А.Лившиц, А .К.Соколов, В.Г.Дебабов, Н.И.Жданова, Ю.И.Козлов, Л.В.Генинг, E.М.Хургес, Т.А.Бачина ,и Л.Ф.Козырева (53) 668.392 (088.8) (14)(57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ 1.-ТРЕОНИНА, предусматривающий проведение операций приготовления посевного материала путем выращивания процудентов треонинабактерий Escherchia coli в посевной

Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к способу получения аминокислоты

L-треонина.

Известен способ получения L-треонина, предусматривающий культивирование его продуцентов бактерий Escherchia coli на питательной среде, содержащей источники углерода, азота, минеральные соли и антибиотик, с после- дующим выделением целевого продукта.

Недостатком известного способа является невысокий уровень накопления треонина, а также большая продолжительность ферментации.

Ближайшим техническим решением по технической сущности и достигаемому эффекту является способ получения

2 питательной среде, введения посевного материала в ферментационную питательную среду, содержащую источники углерода, азота и минеральные соли, добавления гидролизата белоксодержащего субстрата и последующую ферментацию в глубинных условиях, о т л и ч а ю— шийся тем, что, с целью расширения сырьевой базы, а также удешевле. ния способа, в качестве продуцентов треонина используют штамм Escherchia

coli (ВНИИгенетика — 472Т),.при этом выращивание продуцентов ведут в жидкой посевной среде, а добавление гидролизата белоксодержащего субстрата осуществляют непосредственно в посевную питательную среду.

L-треонина, предусматривающий приготовление посевного материала путем выращивания продуцентов треонина— бактерий Escherchia coli в посевной питательной среде, введение посевного материала в ферментационную питательную среду, содержащую источники углерода, азота и минеральные соли, добавление гидролизата белоксодержащего субстрата с последующей ферментацией в глубинных условиях.

Сущность способа заключается в том, том, что в качестве продуцента Lтреонина используют штамм микроорганизмов Escherchia coli ВНИИ генетики

М-1, содержащий амппифицированную гибридную плазмиду, а в ферментационную среду вводят питательную добавку

904325 в виде гидролизатов белоксодержащих субстратов и процесс ферментации ведут в присутствии пенициллина. Посевной материал выращивают в присутствии пенициллина и в виде клеточной суспензии вводят непосредственно в ферментационную среду.

Недостатком этого способа является сравнительно высокий расход таких компонентов ферментационной среды, как глюкоза, пенициллин и гидролизат белоксодержащих субстратов.

Целью предлагаемого изобретения является расширение сырьевой базы, а также удешевление способа, Поставленная цель достигается тем, что в способе получения L-треонина, предусматривающем проведение операции приготовления посевного материала пу- 20 тем выращивания продуцентов треонина— бактерий Escherchia coli s посевной питательной среде, введения посевного материала в ферментационную питательную среду, содержащую источники угле- 25 рода, азота .и минеральные соли, добавления гидролизата белоксодержащего субстрата и последующую ферментацию в глубинных условиях, s качестве продуцента треонина используют штамм

Escherchia coli ВНИИгенетика 472Т, при этом выращивание продуцентов осуществляют в жидкой посевной среде, а добавление гидролизата белоксодержащего субстрата осуществляют непо- средственно в посевную питательную среду.

Сущность предлагаемого способа заключается в следующем.

Штамм Е.coli ВНИИ генетика 472Т получен на основе штамма E.coli ВНИИ генетика М-1 путем введения в клетки этого штамма генетических детерминантов усвоения сахарозы с последующей селекцией на устойчивость к треонину 45 и гомосерину. В качестве донорного штамма, имеющего детерминанты усвоения сахарозы, испольэовали соответствующий штамм Е,coli> в частности, штамм Н-155.

Указанные детерминанты методом конъюгации были введены в штамм

Е.coli 458 требующий для роста треонин, метионин и устойчивый к стрептомицину, а затем из штамма 458 таким же методом — в штамм ВНИИгенетика М1 5 продуцирующий треонин. Отбор рекомбинантов вели на минимальной среде, содержащей сахарозу в качестве единственного источника углерода. В результате был отобран штамм ВНИИгенетика 472, который сохранил способность продуцировать треонин на среде с глюкозой и приобрел способность к накоплению этой аминокислоты на среде с сахарозой или мелассой. В связи с тем, что рост этого штамма подавлялся в присутствии высоких концентраций треонина и гомосерина в среде, были получены спонтанные мутанты, устойчивые к этим аминокислотам при содержании их в среде в количестве более 0,5 г/л. Среди указанных мутантов был отобран штамм ВНИИгенетика

472Т.

Характеристика штамма Escherchia

coli ВНИИгенетика 472Т.

Штамм Е.со1 ВНИИгенетика 472Т, продуцирующий I-треонин, хранится в

Центральном музее промышленных микроорганизмов института "ВНИИгенетика" и имеет регистрационный номер ЦМПМ

В-1960.

Морфология. Грамотрицательные слабоподвижные тонкие палочки с закругленными концами, размером 1,5-2 мм в длину.

Культурально-физиологические признаки.

Мясо-пептонный агар. Через 24 ч роста при 37 С образует круглые беловатые, полупрозрачные колонии диаметром 1,5-3 мм, поверхность колонии гладкая, слегка блестящая, края ровные или немного волнистые, центр колонии приподнят, структура однородная, консистенция пастообразная, легко эмульгируется.

Агаризованная минимальная среда

Адамса с глюкозой. Через 40-48 ч росо та при 37 С образует колонии диаметром 0,5-1,5 мм, серовато-белые, слегка выпуклые, с блестящей поверхностью, через 4-5 суток колонии приобретают слизистую консистенцию.

Рост в мясо-пептонном бульоне. После 24 ч роста при 37 С сильное равномерное помутнение, небольшой осадок, е запах характерный, Рост в жидкой минимальной среде

Адамса. Через двое суток роста в условиях аэрирования при 37 С. сильное равномерное помутнение, запах характерный.

Рост по уколу в мясо-пептонном агаре хороший по всему уколу.

Желатину не разжижает.

4325

1

0,2

1

0,2

Пример 2. Продуцент L-треонина и условия выращива ния посевного материала те же, что и в примере 1, за исключением содержания гидролизата белоксодержащего субстрата, который был использован в количестве 0,2Х, Через 28 ч выращивания посевной мате-. риал (в количестве 10Х от объема среды) ввели в ферментационную питательную среду, имеющую состав, Х:

55 Сахароза

Сульфат аммония . 1

Калий фосфорнокислый 0,2

Двуэамещенный магний сернокислый 0,04

5 90

На молоке — хороший рост с коагуляцией молока.

Индол — образует.

Рост на углеводах: хорошо растет на глюкозе, сахарозе, лактозе, маннозе, галактозе, ксилозе, фруктозе, глицерине, манните.

Устойчивость к антибиотикам— устойчив к пенициллину.

Штамм не патогенен.

Содержание плазмиды. В экспоненциальной стадии роста культуры клетки содержат многокопийную плазмиду (молекулярный вес 5,8 мегадальтон),обеспечивающую устойчивость штамма к пенициллину и несущую гены треонинового оперона.

Клетки продуцента ВНИИ-генетика

472Т выращивают на агаризованной минимальной среде в присутствии пенициллина, а затем суспензией клеток, смытых со скошенного агара, засевают жидкую питательную посевную среду, содержащую источники углерода, азота, необходимые минеральные соли, мел, пенициллин и питательную добавку в виде гидролизатов белок-содержащих субстратов. Посевной материал выращивают в колбах на качалке или в ферментерах при непрерывном аэрировании и перемешивании при температуре 3537 С в течение 20-30 ч.

Выращенный посевной материал вносят в ферментационную среду, содержащую источники углерода, азота и необходимые минеральные соли. В качестве источников углерода применяют сахарозу; глюкозу технический сахар, мелассу. Ферментацию продуцента треонина осуществляют на ферментерах, оснащенных системой PH-статирования, при непрерывном аэрировании и перемешивании при температуре 36 С. о

В качестве титрующего агента при-. меняют аммиачную воду, либо сбалансированную (по углероду и азоту) подпитку. Продолжительность культивирования 30-55 ч. К концу ферментации в культуральной жидкости накапливается до 32 г/л I-треонина. Выделение

L-треонина осуществляют .одним из известных способов.

Пример 1. Культуру продуцента

Е.coli ВНИИгенетика 472Т, выращенную на агаризованной минимальной среде с глюкозой в присутствии пенициллина, пересевали на жидкую посевную питательную среду следующего состава, Х:

Сахароза

Сульфат аммония

Калий фосфорнокислый

Двузамещенный магний сернокислый 0,04

Гидролизат белоксодержащего субстрата 0,5

Пенициллин 0,5 г/л

10 Мел 1

Выращивание посевного материала проводили в колбах Эрленмейера емкостью 750 мл (объем среды — 100 мл) на качалке (240 об/мин) при температуре 35-37 С. Продолжительность выращивания посевного материала 20 ч.

Полученным посевным материалом засевали ферментационную среду (в количестве 5Х от объема среды) следующего

2g состава, Х:

Глюкоза

Сульфат аммония

Калий фосфорнокислый

Двузамещенный магний

25 сернокислый 0,04

Ферментацию проводили в ферментере

\ с рабочим объемом 0 5 л, оборудованном системой РН-статирования. Режим ферментации: расход воздуха 0,5л/мин, перемешивание 900 об/мин РН-< татирование на уровне 7,0-7,2 за счет подачи щелочного титрующего агента, подпитки,.имеющей состав:

Аммиачная вода

25Х-ная, мл 25

Глюкоза, r 60

Вода водопроводная, мп 150

Ферментацию вели при температуре

37 С. Через 36 ч культивирования нао копление L-треонина в культуральной жидкости составило 20 г/л; расход глюкозы на 1 г треонина 4,5 r.

904325

Корректор С.Черни

Редактор Е.Иесропова Техред И.Дидык

Заказ 3086 Тираж 482 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r Ужгород,.ул. Гагарина, 101

Ферментацию проводили в ферментере с рабочим обьемом 0,5 л, оборудованном системой PH-статирования. Условия культивирования продуцента треонина те же, что и в примере 1. Для поддержания РН на уровне 7,0-7,2 использовали водный раствор аммиака с концентрацией ЗЖ. В ходе ферментации по мере снижения концентрации сахарозы в куль-1р туральной среде в ферментер дробно вводили 40Х-ный раствор сахарозы.

Через 54 ч культивирования в культуральной жидкости накопилось 32 г/л

L-треонина, расход сахарозы составил

4 r на 1 r треонина.

Пример 3. Продуцент L-треонина и условия выращивания посевного материала те же, что и в примере 1. Выращенный посевной материал вводили в ферментационную питательную среду, имеющую тот же состав, что и в примере 2. Отличие от примера 2 состояло в использовании мелассы s количестве 16Х (по техническому весу), вме- 25 вместо сахарозы. Условия культивирования продуцента Ь-треонина и методика PH-статирования те же, что и в примере 2..

Через 29 ч ферментации в культу ; ральной среде накопилось 16 г/л Lтреонина, расход сахара на 1 r трео" нина составил 4,8 r.

Как видно из примеров, предлагаемый способ получения Ь-треонина позволяет использовать в качестве источника углерода доступные технические источники углеводов, при одновременном снижении расхода углеводов в .

1,2-1,5 раза по сравнению с известным способом. Кроме того, расход гидролизата белоксодержащих субстратов и пенициллина снижается в 10 раз. При этом, благодаря снижению содержания посторонних примесей облегчается процесс выделения Ь-треонина из культуральной жидкости.