Способ определения биологической активности рнк-лигазы

 

1. СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БИОЛОгаЧЕСКСЙ АКТИВНОСТИ РНК-ЛИГАЗЫ, включающий синтез кольцевых молекул олигорибонуклеотида и определение числа синтезируемых фосфодиэфирных .связей, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа и снижения радиотоксичности, в качестве олигорибонуклеотида используют р(А)„ (А) или р(А) (А). 2.Способ по п. 1, отличающийся тем, что определение числа синтезируемых фосфодиэфирных связей проводят отщеплением или Ьт линейных молекул олигорибонуклеотида добавлением рибонуклеазы 11 и раствора КС1 До конечной концентрации 0,1 м. 3.Способ по п. 1, отли9 чающийся тем, что олигорибонуклеотид р(А),о ррн(А) или р(А) Р (А) получают обработкой поли (А) эндонуклеазой из Serratia mar- , cescens и полинуклеотидфосфорилазой. С

СОО3 СОВЕТСКИХ

WIWM_#_tN

РЕСПУБЛИК (19) (!1) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н ABTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ б .связей, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа и снижения радиотоксичности, в качестве олигорибонуклеотида использу-. ют p(A)qо р(Н)(А) или р(А) р(С) (А) .

2. Способ по п. !, о т л и— ч а ю шийся тем, что определеwe числа синтезируемых фосфодиэфирных связей проводят отщеплением

t H)ÀÊÔ или (С)АИФ от линейных молекул олигорибонуклеотида добавлением рибонуклеазы !! и раствора КС1 до конечной концентрации 0,1 м.

3. Способ по п. 1, о т л и— ч а ю m, и и с я тем, что олигорибонуклеотид р(А)., р(- H)(A) или р(А)

p (C)(A) получают обработкой поли (А) эндонуклеазой из Serratia mar-, (, сезсепз и полинуклеотидфосфорилазой.

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

Fl0 ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 2984113/30-15 (22) 30.06,80 (46) 23.03.87. Бюл, У ll (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт прикладной микробиологии (72) М.И. Болезнин и В.В. Смолянинов (53) 577.155.2(088.8) (56) Василенко С.К., Вельяминова А.Е.

Ямкова В.И., Майоров В.И."Биоорганическая химия", 1979, 5, 62!-627.

Silber R., Иа1аИп Ч.G., Hurwitz Y. "Proc. Nat., Acad. Sci.

USA, 1972, 69, 3009-3013, .(54)(57) 1. СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ PHK-ЛИГАЗЫ, включающий синтез кольцевых молекул олигорибонуклеотида и определение числа синтезируемых фосфодиэфирных (59 4 С,12 Q 1/16, С 12 N 9/00, G 01 N 33/60

91189

1

Изобретение относится к области биохимии, в частности к области выделения PHK-лигаз и рибонуклеаз и изучения их физико-химических свойств.

Известен способ определения био- 5 логической активности РНК-лигазы на первой стадии PHK-лигазной реакции.

Способ не позволяет оценить биологическую активность по числу синтезируемых фосфодиэфирных связей.

Наиболее близким по технической сути и достигаемому результату к предлагаемому способу является способ определения биологической активности РЕК-лигазы, основанный на образовании под дейСтвием фермента кольцевых молекул из (32р) (А), в которых 5 — P группа становится ус г тойчивой к действию щелочной фосфатазы.

Недостатком способа является использование трудно приготавливаемого, субстрата, а .также высокая удельная радиоактивность (P f) — АТФ.

Целью изобретения является упс рощение методики, увеличение воспроизводимости результатов анализа, снижение радиотоксичности.

Поставленная цель достигается в способе определения биологической активности PHK-лигазы, включающем синтез кольцевых молекул олигорибонуклеотида и определение числа синтеэируемых фосфордиэфирных связей, тем, что в качестве олигорибонуклеотида используют р(А) р(Н) (А) или р(А)„р "C)(A)

Поставленная цель также достигается тем, что определение числа синтезируемых фосфордиэфирных связей

40 проводят отщепленньщ f Н) АИФ или (С) АИФ и раствора KCI до конечной концентрации 0,1 И.

Цель достигается также обратной поли (А) эндонуклеазой иэ Serratia

45 шагсезсепз и полинуклеотидфосфоримаэой для получения олигорибонуклеотида р(А)гор1 Н1(А) °

Пример Опред ение биоло- 50 гической активности PHK-лигазы проводили в реакционной смеси (0,1 мл), состоящей из:

50 мИ трис-НСI, рН-7,5

10 И Mgclã

1,3 мИ дитиотрейтол

0,1 мИ АТФ

50 мг/мп бычьего сывороточного альбумина

9 2

0,04 мИ р(А) р(Н)(А) или р(А) р (С)(А) 0,05-0,5 ед. PHK-лигазы. о

Смесь инкубировали при 37 С

30 мин, прогревали при 100 С 2 мин для инактивации PHK-лигазы, охпажо дали до 37 С и после добавления

0,1 ед. рибонуклеазы 11 и КСI до

0,1 М инкубировали при 37 С еще

30 мин. Реакцию останавливали добавлением 50 мкл раствора т-РНК (5 мг мл) и 2 мл 10 -ной трихлоруксусной кислоты. Осадок наносили на нитроцеллюлоэные фильтры диаметром пор 0,45 мкм, промывали 5. порциями 10 -ной трихлоруксусной кислоты по 5 мл, высушивали и радиоактивность определяли на жидкостном сцинтилляционном счетчике. За 1 ед. активности PHK-лигазы принимали количество .фермента, делающего устойчивым к рибонуклеазе 11 1 нИоль р(А) „

p) Í)(А) или р(А) р $ CJ(A) (в пе- ресчете на нуклеотид или фосфатный о конец) за 30 мин при 37 С. с

Для получения р(А), который является субстратом для определения биологической активности PHK-лигаз, 42 мг поли (А) обрабатывали эндонуклеазой из Бегratia шагсезсепв в реакционной смеси (2 мл);

50 .мИ трис-НСI, рН вЂ” 8 1

5 И И8С1, 42 мг поли (А)

260 ед. эндонуклеазы о

Смесь инкубировали при 37 С

20 мин, прогревали при )00 С 5 мин, охлаждали до комнатной температуры и диализовали против 10 мИ трис-HCI буфера, рН-8,2 для удаления мелких олигонуклеотидов.

Для получения р(А) p(H)(A), р(А) обрабатывали полинуклеотидфорилазой в реакционной смеси (I мл):

0,1 M трис-HCI рН вЂ” 8,2

2,5- MgC1<

0,1 мг бычьего сывороточного альбумина

1 мг р (А) о

0,5 Ки (11,3 Ки!мИоль) (Н)АДФ

2 ед. полинуклеотидфорилазы (При использовании j C)ÀÄÔ количество молей его должно соответствовать количеству молей (Hj АДФ).

Смесь инкубировали при 37 С 4 ч.

Олигорибонуклеотиды экстрагировали фенолом, насыщенным водой. Фенол удаляли экстракцией эфиром. Раствор р(А} p(Н)(А) диализовали против

Редактор П. Горькова .Техред А.Кравчук

Корректор И, Муска

Заказ 908/3 Тираж 500

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб,, д. 4/5

Подписное

Производственно-полиграфическое предприятие, r. ужгород, ул. Проектная, 4

3 9

3 смен по 1 л О,l м NaC1 в течение

24 ч и хранили при -20 С. Препарат сохраняет свою активность в течение года.

Применение субстрата р(А) р(Н)

Г 14 ао (или С1)А для определения активности PHK-лигазы позволяет в течение года использовать один и тот же препарат олигорибонуклеотида, что существенно повьппает воспроизводимость

11899 4 анализа. После проведения PHK-лигаэной реакции отщепление (С)АМФ или (Н)АМФ производят рибонуклеазой 11 в присутствии 0,1 М КС.l.

Субстрат для PHK-лигазной реакции получают с применением только двух ферментов, при этом в качестве метки используют долгоживущие и менее ра19 диотоксичные изотопы (Н) или P С) .