Способ получения галактозооксидазы

 

Союз Советскик

Социалистических

Республик

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (111 889705 (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 020779 (21) 2802012/28-13 с присоединением заявки М (23) Приоритет—

Опубликовано 15,1281. Бюллетень N9 46

Дата опубликования описания 151281 (53)М. Кл З

С 12 N 9/04

Государственный комитет

СССР

00 делам изобретений и открытий (53) УДК 582. 288

088 ° 8) (72) Авторы изобретения

T.T.Буглова, Т.С.Кириленко и И.Я.Захарова

Ордена Трудового Красного Знамени институт микробиологии и вирусологии им. акад. Д.К.Заболотного (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГАЛАКТОЗООКСИДАЗЫ

Изобретение относится к микробиологической пром".тленности, а именно к производству ферментных препаратов.

Галактоэооксидаза используется в клинических и научно-исследовательс,ких биохимических лабораториях в качестве аналитического препарата для количественного определения галактозы в различных биологических материа- 1О лах.

Известны способы получения близкого по механизму действия фермента глюкозооксидаэы путем глубинного культивирования микроскопических грибов Aspergi11us u Penicillium в при —сутствии гидрата сульфата магния, первичного кислого фосфата калия и источника азота-нитрата или аммониевой соли. Активность фермента в культуральной жидкости 3-6 тыс. ед/л (1).

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому положительному эффекту является способ получения галактоэооксидазы, предусматривающий культивирование продуцирующего фер-. мент микроорганизма на питательной среде, содержащей источники углерода, азота, минеральные соли и воду, глубинным методом в условиях аэрации с последующим выделением фермента.

Способ заключается в глубинном культивировании базидиального гриба

Pol yporus c i rcinatus штамм NRRL 2903, хранящегося в коллекциях США и Бразилии. Продуцент синтезирует внеклеточную галактоэооксидазу на среде следующего состава, г/л воды:

Галактоэа 10

Фосфат калия однозамещенный 9

Фосфат натрия двузамещенный 8

Сульфат аммония 2

Сульфат меди 0,025

Сульфат марганца 0,002

Сульфат магния 0,2

Нитрат аммония 1

Дрожжевой экстракт 1 рН среды 6,8 — 7,0.

Ферментация ведется при 25 С на качалке с 200 об/мин или в ферментерах, продолжительность выращивания 72

96 ч. Галактоэооксидаэная активность культуральной жидкости 20 — 50 ед/мл

1 2).

Недостатком данного способа является применение в качестве продуцента галактоэооксидазы труднодоступного для использования штамма NRRL

2903 базидиального гриба Polyporus

889705 сirciпаtu s, нестабильность галактозооксндазной активности в культураль.яой жидкости при глубинном выращивании продуцента на известной среде (после достижения максимума наблюда,ется резкое падение активности иэ-эа присутствия в мицелии .гриба ингиби тора неизвестной природы) и наличие примесей каталаэы в препаратах галактозооксидаэы, полученных известным способом.

Цель изобретения — получение целевого продукта беэ примеси каталазы, пероксидазы и галактозодегидрогеназы и улучшение таким образом качества продукта.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения галактоэооксидазы, предусматривающе- му культивирование,продуцирующего фермент микроорганизма на питательной среде, содержащей источники углерода, азота, минеральные соли и воду, глубинным методом в условиях аэрации с последующим выделением фермента из культуральной жидкости, в качестве продуцирующего микроорганизма используют штамм Fu sarium grami

nearum ИМ — F Р 1060.

Штамм Fusarium gramiriearum ИМВ

F 9 1060 выделен в 1976 г. из корней пшеницы на территории Украины и имеет следующую характеристику:

Морфология. Культура Fusarium

graminearum ИМ — F 9 1060 образует субстратный, надсубстратный и воздушный разветвленный с поперчными перегородками мицелий. Толщина гиф субстратного и надсубстратного мицелия от 2,7 до 10,8 мк, воздушного

2,0 — 5,9 мк. Конидиеносцы обычно разветвленные в верхней части, на верхних спороносных клетках конидиеносцев (размер 13,5 — 27,0 х 2,7

3,2 мк) располагаются фиалиды по 24 в мутовке, размеры фиалид 10,8

13,5 х 2,7 — 3,0 мк.

Конидии веретено-серповидные, суженные к обеим концам, располагаются на верхушках фиалид пачками по

12-38 шт,и больше, образуя пионоты. . Размеры конидий 45-86 х 3,5 — 5,4 мк.

КУЛьтура Fusarium graminearum " штамм ИМВ-F Р 1060 быстро растет на сусло-агаре, агаре Сабуро, Чапека, Чапека-Докса, картофельном агаре, колонии на седьмые сутки достигают

90 мм в диаметре, высота 12-15 мм, р=.тхлые, войлочно-клочковатые.

Субстратный и надсубстратный мицелий винно-красный, карминный, воздушный мицелий розовый, светло-винно-красный, местами абрикосово-желтый. На обратной стороне колонии темно-красные.

Купьтуральные и биохимические свойства. На сусло-агаре, среде Чапека-Докса, Сабуро, мальц-агаре, картофельном и картофельно-глюкоэном

20,0

8,0

0,2

О, 025 агаре куды ура Fu sa r i uin g rami ne arum штамм ИМВ-F Р 1060 растет хорошо, воздушный мицелий и спороносный слой обильный.

В качестве единственного источника углерода предлагаемый штамм использует галактозу, глюкозу, маннозу, фруктозу, L — арабинозу, L — рамнозу, лактозу, сахарозу, мальтоэу, раффиноэу. Усваивает нитратный и аммонийный азот, однако лучшим источником азота является мочевина. На известной полусинтетической среде при глубинном способе выращивания синтезирует внеклеточную галактозооксида1 зу. Активность культуральной жидкости на 72-ом часу выращивачия 5-6 ед/ йл.

Для повышения активности культуральной жидкости штамм Fusa ri um g raminearum ИМВ-F Р 1060 вырацивают на

20 среде следующего состава, г/л воды:

Галактоза 15 — 20

Фосфат калия однозамещенный 7 — 9

Фосфат натрия двузамещенный 6 — 8

Сульфат магния 0,2 — 0,4

Сульфат меди 0,025 — .0,05

Мочевина 5 — 10

Дрожжевой экст30 р акт рН среды 6,8 — 7, О.

Способ получения галактозооксидазы состоит из двух стадий.

Стадия 1.. Выращивание вегетативного инокулума.

Предлагаемую среду засевают маточной культурой Fusarium graminearum штамм ИМВ-F Р 1060, выращенной на суслс-агаре. Выращивание инокулума производят на качалке с 200

40 220 об/мин 24-28 ч при 28 С + 1 С.

Стадия .2. Биосинтез галактозооксидазы.

В колбы, содержащие среду того же состава, вносят 1-2% инокулума к

45 обьему среды. Ферментацию ведут на качалках с 200-220 об/мин при 28 С+

+1eC 72-80 ч. Активность культуральной жидкости к окончанию ферментации 15-25 ед/мл, в течение следующих

24-40 ч активность остается стабильной, а затем медленно снижается.

Выделяют галактоэооксидазу из культуральной жидкости известным способом.

Пример 1. Выращивание инокулума штамма Fusarium gramiпеаrum

ИМВ-F 9 1060 производят в колбах емкостью 500 мл с 250 мл среды, содержащей, г/л воды:

Галактоза

60 Фосфат калия однозамещенный 9,0

Фосфат натрия двузамещенный

Сульфат магния

65 Сульфат меди

889705

Формула изобретения

Составитель И. Привалова

Редактор M.Ïåòðoâà Техред Т.Маточка Корректор М.демчик

Заказ 10898/44 Тираж 531 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж- 35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Мочевина 5,0

Дрожжевой экстракт 2,0 рН среды 6,8 — 7,0.

Среду стерилизуют при 125 С 30 мин.

Отдельно готовят и стерилизуют раст- 5 воры галактоэы и сульфата меди, которые вносят стерильно в колбы перед посевом. Засевают колбы вегетативным мицелием культуры Fu sarium дraminеаrum штамм HNB-F 9 1060, выращенной в течение семи суток на сусло-агаре.

Выращивание инокулума ведут на качалке с 200-220 об/мин 28 ч при 28 С.

Посевной материал в количестве 1% к объему среды вносят в ферментационные колбы емкостью 500 мл с 250 мл среды того же состава. Ферментацию ведут при 28 С на качалке с 220 об/мин о

80 ч. Активность культуральной жидкости к концу ферментации 15 ед/мл.

Активность галактозооксидазы измеряют пероксидазо-хромогенным методом. Принцип метода состоит в том, что образующаяся при ферментативном окислении галактозы перекись водорода при участии пероксидаэы окисляет 2S хромогенный акцептор кислорода (одианизидин), оптическую плотность которого измеряют при длине волны

420 нм. 3а единицу активности фермента принимают то его количество, кото- 30 рое вызывает изменение оптической плотности на одну единицу при длине волны 420 нм в 1-сантиметровых кюветах в течение 10 мин в условиях опыта. 35

Выделение галактозооксидазы иэ культуральной жидкости осуществляют известным способом.

Пример 2. Выращивание инокулума Fusarium graminearum HMB-F

9 1060 ведут на среде следующего состава, г/л воды:

Галактоза 20,0

Фосфат калия одно.— замещенный 9,0

Фосфат натрия двузамещенный 8,0

Сульфат магния 0,2

Сульфат меди 0,025.

Мочевина 10,0

Дрожжевой экст- 50 ракт 3,0 при рН среды 6,8 — 7,0 в условиях примера 1. Ферментацию проводят на среде того же состава в условиях при мера 1. Активность культуральной жидкости на 80 ч ферментации 25 ед/мл.

Активность ферментного препарата стабильна в течение 1,5 лет при 4 С.

Препарат может быть использован для разработки ферментативного метода определения галактоэы.

Полученный предложенным способом препарат галактоэооксидазы обладает высокой специфичностью, катализируя окисление только галактоэы, ее производных, а также олиго- и полисахаридов, в состав которых входит галак" тоза (а - и р -метил-Д-галактозиды, Д-галактозамин, Й вЂ” ацетилгалактозамин, галактоэо-1-фосфат, УДФ-галактоза, лактоэа, раффиноза). Препарат галактозооксидазы-не-содержит примесей других ферментов — каталазы, пероксидазы, галактоэодегидрогеназы, могущих влиять на скорость галактозо-оксидазной реакции..

Способ получения галактозооксидаэы, предусматривающий культивирование продуцирующего фермент микроорганизма на питательной среде, содержащей источники углерода, азота, минеральные соли и воду, глубинным методом в условиях аэрации с последующим выделением фермента из культуральной жндкости, отличающийся тем, что, с целью получения целевого продукта без примесей каталазы, пероксидаэы и галактозодегидрогеназы и улучшения таким образом качества продукта, в качестве продуцирующего микроорганизма используют штамм Fusa rium graminea rum ИМВ-F 9 1060.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Патент США 9 3701715, кл. С 12 D 13/10,,опублик. 1972.

2 . С .Ачigad, D..Amara1, С .Asenвiо, В .L .Ho reeker . The d-galactose ox ida se of Polyporus cirñinatus J Biо1.

Chem . 1962, 237, 9 9, 2736-2743 .(прототип).