Способ определения биологической активности химических соединений

 

ОП ИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Советскнк

Социапнстнчесннк

Республик

<н 918854 (61) Дополнительное к ает. свнд-ву (22) Заявлено 300390 (21) 2991444/30-15 (Я)м. кл.

0 01 N 33/48 (; 01 N 24/00 с прнсоеанненнен заявки пв

9кударствкккык ккнвтат

CCCP ао делан иэокретеннв и открытий (23)ПрнорнтетОпублнковано 070М2- Бюллетень И 13 (53) УДК543;42:

:612. 111 (088 8)Дата опубликования описания 0704р2

H.И.Эмануэль, К.Е. Круглякова и Л.Я. Ген4ель "= "------.— и О .И.Панасенко

Г..

Ордена Ленина институт химической физик

- АН СССР

{72) Авторы изобретения (71) Заявитель (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКОЙ

АКТИВНОСТИ ХИИИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ

Изобретение. относится к физикО" химическим методам выявления notesциальной биологической активности химических соединений как структуромодифицирующих факторов в отношении биологических мембран и может быть использовано при поиске практически ценных биологически активных препа- ратов,,например пестицидов.

Известен способ определения биоло" гической активности химических соеfO динений, в котором в качестве тестобъекта используют либо подопытных животных, либо ткани их различных органов. Измельченные ткани гомогенизируют, подвергают воздействию испытуемого химического соединения.

В гомогенатах и субклеточных фрак" циях определяют свободную и общую активность гликозида. Общую активность ферментов исследуют после полного разрушения субклеточных структу"р путем добавления в инкубационную среду тритона Х-100.

По изменению уровней активности этих ферментов определяют биологическую активность испытуемых соединений 31).

Однако известный способ предусматривает использовать в качестве тестобъекта либо ткани различных органов подопытного животного, либо организм в целом, что затрудняет однозначную интерпретацию механизма действия испытуемых соединений. Способ дает возможность судить только о функциональных изменениях лизосомальных ферментов и не дает никакой информации о структурной модификации мембран при воздействии химических соединений.

Кроме того, известный способ тру доемок и предусматривает проведение эксперимента, по крайней иере, в те" чение суток.

Целью изобретения является ускорение способа, повышение его чувствительности и информативности.

3 9

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу в качестве тестобъекта используют плазматические мембраны эритроцитов животных организмов, после воздействия на тест-объект

S химическими соединениями в негр вводят спиновой зонд в концентрации

0,1-0,5 мИ, добавляют аскорбат натрия в концентрации 10-25 мМ, затем измеряют скорость аскорбат-индуциро10 ванного восстановления зонда, по изменению которой судят о биологической активности химических соединений.

Скорость восстановления зондов обусловлена скоростью проникйовения аскорбат-аниона во внутримембранное пространство, а последняя, в свою очередь, существенным образом зависит от структурного состояния мембраны, которое может изменяться при обработке мембраны биологически ак20 тивными препаратами. Измеряя, таким образом, скорость восстановления зондов, локализованных в обработанной химическими соединениями мембране, аскорбатом натрия и сравнивая ее с таковой при отсутствии химических соединений (контроль) определяют биологическую активность испытываемых веществ как структуро-модифици30 рующих Факторов в отношении биомембран.

На чертеже представлены кинематические кривые восстановления зонда.

Пример. Плазматические мембраны эритроцитов, так называемые

"тени" эритроцитов, получают из свежей бычьей крови. Для этого эритроциты отделяют от плазмы центрифугированием в течение 20 мин при 1000g, 0 затем трижды промывают раствором

0,94-ного хлорида натрия, центрифугируя в течение 15 мин при 1000g.

Далее проводят гемолиз в растворе трис-HCl (5 мМ, рН 7,8), содержащем

2 мИ ЭДТА, 1 мИ сульфата магния.

Смесь центрифугируют 15 мин при

15000g. Супернатант удаляют. Подобную операцию повторяют 3 - 4 раза.

Отношение объема эритроцитов к объему гомолизата поддерживают

1:10. Затем ионную силу буфера no"" нижают в 2 раза(трис-HC1 - 2,5 мМ, рН.7,8, 2мИ ЭДТА, 1 мИ сульфата магния) и гемолизат вновь центрифугиру- И ют при 15000g в течение 15 мин. Супернатант удаляют (операцию повторяют 2 раза) . Последнюю стадию от18854,4 мывки "теней" от гемоглобина прово-, дят в растворе трис-НС1 (1 мМ, рН

7,8) при 20000g в течение 15 мин (2 раза). Полученную суспензию концентрируют путем центрифугирования при 100000g в течение 30 мин, предварительно суспендируя ее в растворе трис-НС1 (50 мМ, рН 7,8). Все операции по получению "теней" осуществляют при 4 - 6 С.

ЭПР-измерения проводят на радиоспектрометре РЭ-1306 при 18-20 . К

100 мкл полученной суспензии мембран (концентрация белка по Лоури составляет 12,5 мг/мл) добавляют спиртовый раствор.ДДТ так, чтобы концентрация ДДТ в среде измерения составляла 0,5 мМ. Смесь инкубируют 60 мин при комнатной температуре, затем добавляют спиртовый раствор зонда (2,2,4,4-тетраметил-9-гексил- 1,2,3,4-тетрагидро-5,6-бензо-g -êàðáoëèí-3-оксил) причем конечная концентрация зонда равна,2,5 х 10 И, а этанола - не более 44 по объему. Смесь инкубируют 30 мин при комнатной температуре, после чего добавляют раствор аскорбата натрия в буфере трис-пС1 50 мМ; рН 7,8. Суспензию тща" тельно перемешивают и через 510 мин регистрируют 2 спектра ЭПР с интервалом 3 мин. Определяют соотношение центральных компонент спектров. Оно составляет 0,89. По номограмме (чертеж) находят, что значение 1<0,017 мин-"..

Контроль. К 100 мкл полученной суспензии "теней! (концентрация белка по Лоури составляет 12,5 кг/мл) добавляют спиртовый раствор зонда (2,2,4,4»тетраметил-9-гексил-1,2,3,4-тетрагидро-5,6-бензо- -карболин-3"оксил) так, чтобы конечная концентрация этанола в среде измерения не превышала 44 по объему, а зондасоставляла 2,5 х 10 4 M. Суспензию инкубируют 30 мин. при комнатной температуре. Затем к полученной смеси добавляют раствор аскорбата натрия в буфере трис-НС1 (50 мМ, рН 7,8), начальная концентрация которого составляет 17,5 мМ. Смесь тщательно пе-ремешивают и через 5-10 мин регистрируют.2 спектра ЭПР с интервалом

3 мин. Определяют соотношение интенсивностей центральных компонент спектров ЭПР. Оно составляет 0,81.

Ilo номограмме (чертеж) определяют

k< для этой реакции (k>=0,030 мин ) 5 918854

Зная ko и k, по уравнению рассчиты-. веществ ни

С -0 ° 5 с

5о 1-1с7)со Препарат где с - концентрация испытуемого пре-5 парата;

Лд, /Kr (для крыс) 0,40

85-I00 фозалон

0,58

250-400

10- 150 (для человека) 2IO-280

ПХФ

0 73

4,00

1080-1180

Роннел

)10,00

>10,00

1500-4000

Линурон

Дилор

5000-9000

Использование в качестве тестобъекта "теней" -эритроцитов животных организмов для определения биологической активности химических соединений имеет следующие. преимущества; повышается информативность способа, так как, с одной стороны, плазматические мембраны зритроцитарных клеток непосредственно взаимодействуют с биологически активными веществами, попадающими в кровь организма из биосферы, а с другой стороны, структурное состояние мембраны является одним из определяющих факторов функционирования зритроцитов, а значит и организма в целом; "тени" однородны по составу и относительно легко мо" гут быть получены, можно легко получить инвертированные "тени", что дает возможность изучать влияние хи" мических соединений не только на внешнюю, но и на цитоплазматическую поверхность мембраны; "тени" представляют собой препарат, по существу, не загрязненный компонентами других органелл клетки и ее .цитоплазмы, Использование в качестве спиновых зондов нитроксильных радикалов, отличающихся физико-химическими свойствами и локализацией в биомембране, увеличивает чувствительность способа и позволяет получать дополнительную информацию о структурной модификации различных ее областей. Преимущества предлагаемого способа заключаются также в возможности работы с микроko - константа скорости реакции при отсутствии химического соединения;

k - константа скорости реак- 1в ДД ции в присутствии химичес" кого соединения;

С О - концентрация химического соединения, вызывающая уменьшение k/kо на 504.

В качестве параметров, характеризующих скорость реакции, могут быть выбраны начальная скорость восстановления радикальных центров (опре" деляется как тангенс угла наклона касательной к кинетической кривой восстановления зонда в начальный момент времени), время полувосста" новления радикалов и константа ско" . рости реакции (определяется как тангенс угла наклона полулогарифмических анаморфоз .кинетических кривых}.

Строят зависимость V/Vo, (Т,,, /Т

k/k,где V, (T„lk)o 1со и V, Т1,kначальная скорость восстановления зондов аскорбатом, время полувос становления, константа скорости реакции при отсутствии и в присутствии испытываемого соединения соответст: венно, от концентрации испытываемого химического соединения.

Зная отношение интенсивностей центральных компонент двух спектров

ЗПР Ь, и h записанных через интервал времени ut, можно определить константы скорости реакции k и k по номограмме (чертеж).

По аналогичной методике было изучено влияние фозалона, пентахлорфемолята натрия (ПХФ-Na), роннела, линулона, дилора на структуру эритроцитарной мембраны. В таблице приведены оцененные значения С о для всех исследованных соединейий, а также указаны их дозы, вызывающие 503-ную гибель подопытных животных (ЛД ). †., Следует обратить внимание на тот факт, что между величинами С о и

ЛД р существует корреляция . чем боль". ше ЛД О, т.е. чем менее токсичным является соединение, тем больше С о .

Зто расширяет возможности предлагаемого способа и позволяет оценивать токсические свойства испытуемых

6 в отношении животных оргаФормула изобретения о д2

Я t, rue

Л7

ВНИИПИ Заказ 2129/27 Тираж 883 Подписное

Ф «» ° ФФ

Филиал Wfl "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4

7 91 количествами веществ (максимальное количество необходимого вещества не превышает 5 мг) и автоматизации процесса первичного скрининга химических соединений.

Предлагаемый способ позволяет получить быструю информацию а биологической активности химических соединений в течение 30 - 100 мин.

Способ определения биологической активности химических соединений путем их воздействия на тест-объекты, отличающийся тем, что, с целью ускорения способа, повыше8854 8 ния его чувствительности и информативности, в качестве тест-объекта используют плазматические мембраны эритроцитов животных .организмов, посз ле воздействия на тест-объект химическими соединениями в него вводят спиновой зонд в концентрации О, 1"

0,5 мй,- добавляют аскорбат натрия в концентрации 10-25 мИ, после чего о измеряют скорость аскорбат- индуцированного восстановления зонда, по изменению которой судят о биологической активности химических соеди нений.

Источники информации, принятые ео внимание при экспертизе

Авторское свидетельство СССР

Н 675649, кл. С 01 N 33/16,02.02.76.