Способ иммобилизации амилоризина г 10х

 

(72) Авторы изобретения

М. М. Рахимов, М. Х. Таджиев и Х. Т. Х

Среднеазиатский научно-исследовательский конструкторский институт пищевой промышл (71) Заявитель (54) СПОСОБ ИММОБИЛИЗАЦИИ АМИЛОРИЗИНА Г10х

Изобретение относится к получению иммобилизованных ферментных препаратов и может найти применение в пищевой промышленности.

Ферментные препараты, используемые в пищевой промышленности, и, в том числе, амилорезин Г10х, обладают низкой стабильностью, особенно после дополни тельной очистки. В связи с этим необходимо проводить иммобилизацию фермент. ных препаратов с целью их стабилизации.

Одним из широко используемых в пищевой промышленности ферментных препаратов является амилоризин Г10х (обработка соков, виноматериалов, пива, обработка водномучнистых смесей и теста, обработка рыбы, приготовление кваса, получение цукатов и др,).

Известен способ иммобипизации амилоризина на силикагеле. Иммобилизация фермента по этому способу происходит эа счет адсорбции амилоризина в порах неорганического носителя. При этом весовое соотношение ферментного препарата

2 и носителя должно составлять 1:(200400) (1 ) .

Недостатком данного способа является большой расход носителя (силикагеля), в результате чего удельная активность s расчете на нелевой стабилизированный препарат снижается, хотя при адсорбции амипоризина и наблюдается активация ферментного препарата. Другим недостач ком способа является то, что связь между препаратом н носителем является адсорбционной, в результате чего может происходить адсорбция ферментного препарата с силикагеля и последующая инактивация амилориэина.

Известен также способ иммобилизации амилориэина Г10х на полимерных носителях, в котором в качестве полимерного носителя используют. нерастворимый сополимер М -винилпирролидона с гляцеди20 ловым эфиром метакриловой кислоты. Иммобилиэацию проводят при соотношении ферментного препарата и носителя 1:3 по веск при 7-10 С и рН 2,5-Л,S в 0,1 M

922141

50 универсальном буфере. Иммобилизация достигается за счет образования ковалентных связей между аминогруппами ферментного препарата и эпоксигруппами полимера j2) .

Недостатком известных способов иммобилизации амилоризина является нерастворимость целевых продуктов, что значительно снижает их каталитическую активность в отношении нерастворимых субстратов и, следовательно, сужает область применения иммобилизованного амилоризина в пищевой промышленности.

Недостатком известных способов является также и то, что стабилизирующее действие иммобилизации проявляется в небольшом диапазоне температуры и рН среды.

Целью изобретения является увеличение каталитической активности ферментного препарата, а также его стабильности в более широком диапазоне температуры и Рн среды.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу иммобилизации амилорнзина Г10х на полимерных носителях на основе 8 -винилпирролидона, в качестве полимера используют водорастворимый сополимер N <винилпирролидона и акриламида, модифицированный госсиполом, при этом иммобилизацию проводят при соотношении фермента и полимера от 1:10 до 1:4 по весу в 0,050,1 М буфере при рН 8,0-9,5 и 4-16 Св течение 16-24 ч, а затем осаждают целевой продукт трехкратным объемом холодного ацетона.

Иммобилизация происходит за счет того, что реакционноспособные альдегидные группы сополимера взаимодействуют в щелочной среде с амцногруппами ферментного препарата с образованием устойчивой ковалентной связи. В результате такого связывания повышается устойчивость фермента к высокой температуре, а также расширяется диапазон рН стабильности фермента к щелочным и кислым средам. Каталитическая активО ность иммобилизованноцо предлагаемым способом амилоризина в отношении нерастворимых субстратов значительно выше, чем при.иммобилизации известными способами за счет иммобилизации на о водорастворимом полимере.

Сополимер, используемый для иммобилизации амилоризина, приготавливают следующим образом в два этапа, 4

На первом этапе проводят сополимеризацию и -винилпирролидона с акриламидом. Для этого смешивают 26,24 r 8 винилпирролидона и 14,6 г акриламида

А, и к смеси добавляют 10,6 мл перекиси водорода (3 -ной) и 100 мл воды.

Реакционную смесь нагревают 10 ч при

60-65 С. Полученный воскообразный о продукт разбавляют 50-60 мл воды и осаждают 2-3-кратным количеством ацетона. Образовавшийся осадок высушивают в вакуумсушильном шкафу. Выход сополимера 85%. Характеристическая вязкость сополимера Col = 0,78. Ñîäåð15. жанне мономеров в полученном сополимере составляет, мол.Ъ N -винилпирролидона 43, а акриламида 57.

На втором этапе к водорастворимому сополимеру М -винилпирролидона с акриламидом добавляют госсипол для модифи» кации аминогрупп сополимера, К 40 мл раствора сополимера (25 мг/мл) добавляют 16 мл (1 мгlмл) госсипола и выдерживают при 30-40 С,в течение 3-4ч.

Полученный продукт (сополимер М -винилпирролидона и госсиакриламида) ocaK.дают добавлением избытка ацетона. (двухкратный объем), промывают и сушат.

Соотношение мономеров N -винилпирролидона и акриламида, а также сополимера и амилоризина можно варьировать в широких пределах. Изменяя число функциональных групп сополимера, можно получить целевые продукты с различными удельными активностями и стабильностью.

Изменяя соотношение стабилизирующей полимерной добавки и ферментного препарата можно также получить препараты с разной стабильностью, о

П, р и м е р 1 . В раствор 1 г ферментного препарата амилоризина Г10х с удельной активностью 2000 ед/г в

50 мл 0,1 М универсального буфера (Н ВО, Н РО, СН СООН,; NOH) при рН 8,8 вводят 1 г сополимера. Смесь тщательно перемешивают и оставляют с при 4 С в течение 16 ч. о

После инкубации в течение указанного времени образовавшийся продукт осаждают тремя объемами холодного ацетона.

Осадок отделяют декантацией, промывают вновь ацетоном и определяют в нем количество связанного ферментного пре . парата. Удельная активность иммобилизованного ферментного препарата состав ляет 820 ед/г в расчете на сухой прое дукт или 1810 ед/г в расчете на связавшийся амнлоризин.

Таким обрюзомр при исп1жйззовании предлагаемого изобретения катапитическая активность иммобилиэованного на растворимом полимерном носителе амилориэина увеличивается. Стабильность полученного фермента выше. Время попуинактивации при 50 С увеличивается в

10 раз. Температурный диапазон применения ферментного препарата расширяется.

Ферментный препарат можно применять в ,более. широком диапазоне рН среды.

ТаблицаХ

Зависимость каталитической активности иммобилиэованного амилориэина Г10х от рН среды

Ф

Катадитическая активность, при рН

5,0 5,56,,0 6,,5 Б,О 7,5

19 20 16 145 12

3,5 4,0 4,5

Способ 3,0

Известный 05

1,2 1,65 1,82

Предлагаемый 275 365 400 420 423 420 410 325 230 165

" активность амилоризина в расчете на r сухого препарата.

5 922

Пример 2 . Все операции прово. дят как в примере 1, но в 50 мл буфера рН 8,8 растворяют 200 мг амилоризина Г10х. Удепьная активность иммобилиэованного амилоризина составляет

231 ед/г в расчете на вес сухого продукта.

Пример 3 . К 1 г сополимера . добавляют 1 г амилоризина Г10х, предварительно растворенного в 50 мл о

0,05 М буферного раствора-рМ 8,0.

Смесь перемешивают и оставляют при

4 С в течение 24 ч.

Остальные процесс@ проводят аналогично примеру 1. Удельная активность 15 иммобилизованногб амилориэина состав ляет 610 ед/г в расчете на вес сухого продукта.

Пример 4 . К навеске сополи- мера 500 мг добавляют 50 мл раствора„ 20 содержащего амилориэин г10х (500 мг), рН 9,5. Смесь оставляют при

16=С в течение 16 ч..Остальные операции проводят как в примере 1. Удельная активность иммобилизованного амилори/25 зина составляет 540 ед/г в расчете на вес сухого продукта.

Соотношение полимерной добавки и ферментного препарата можно варьировать в широких пределах, однако оптимальным является весовое соотношение 1:1 при о35 С.

Как видно иэ табл. 1-3, предлагаемый способ позволяет получить стабильный ферментный препарат, способный функцио- 35 пировать при 30-70 С в широком диапаЮ зоне рН 3,0-7,0.

141 о

В таблицах приведены характеристики нммобилиэованных иэвестяам и предлагаемым способом препаратов амилоризина, а также неиммобюпюзованного ферментного препарата.

Полученный цепевой продукт имеет более высокую каталитическуто активность - 820 ед/г. При нагревании полученный иммобилиэованный амилориэин дольше сохраняет свои каталитические свойства (табл. 2).

Полученный иммобилизованный амииориэин может быть использован в ряде тгроизводств, в частности при осветлении виноматериалов (табл. 5). Осветление достигается уже через 96 ч, в то время как в случае применения исходного mm-: лоризина аналогичные показатели можно получить лишь через 15-20 сут.

При внедрении предлагаемого способа в производство дпя попучения иммобилизованного амилориэина не требуется дорогостоящего носителя, бифункциональных агентов. Сополнмеры получаются простым, дешевым приемом, сшивающий агент легко доступен.

022141

Таблипа 2

100

100

100

100

100

100

12

100

100

3 ч

100

5 ч

100

7 ч

8 ч

10 ч

Таблица3

Известный

Предлагаемый

Т а б л и ц а

Удельная активность, ед/г

20 мин

40 мин

60 мин

120 мин

Соотношение полимерной добавки и фер« ментного препарата (по весу) Изменение активности амилоризина Г10х в растворе при 50ОС H pH 4

Каталитическая активность иммобилизованного амилоризина Г10х при различных температурах

2,0 3,0 4,4 5,5 6,0 5,2 4,7 1,8

250 460 670 750 790 820 720 490 300

10:1 5:1 1,7»1 1,2:1 1:1 1,2:1 1:4

180 231 263 408 458 433 ЗЗО

922i4i

Таблица5

Применение иммобилизованного амилоризина для получения осветленных виноматериалов

0,009

9,2

14,4

14,3

0,010

63

12,0

0,015

0,020

14,0

14,0

14,5

П р и м е ч. а н и е. Указано суммарное время, включая и время отстаивания.

Формула изобретения

Составитель B. Муромец

Редактор Л. Лукач Техред А.Бабинец Корректор Л. Бокщан

Заказ 2505/34 Тираж 505 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", r..Óæãîðoä, ул. Проектная, 4

Способ иммобилизации амилоризина

Г10х на полимерных носителях на основе

-винилнирролидона, о т л и ч а ю— шийся тем, что, с целью увеличения катапитической активности ферментного препарата, а также его стабильности в более широком диапазоне температуры и рН среды, в качестве полимерного носителя используют водорастворимый сополимер Я -винилпирролидона и акриламида, модифицированный госсиполом, при этом иммобилизацию проводят при соотношении фермента и полимера от 1:10 до 4:1 по ,весу в 0,05 — 0,1 М буфере при рН

8,0-9,5 и 4-16 С в течение 16-24 ч, а затем осаждают целевой продукт трехкратным объемом ацетона.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

ЗО

1. Абдумаликов М. Х. и др, Изучение активации амилоризина Г10х силикагелем. — Прикладная биохимия и микробиология", 1977, т. 13, № 5, с. 692-695.

2. Таджиев М. Х. и др. Стабилизация и иммобилизация ферментов полимерами с функциональными эпоксигруппами. - «Прикладная биохимия и микробиология", 1978, т. 14, No 5 с. 703-708, (прототип).