Способ количественного определения мебикара в биологических жидкостях
ОП ИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ
Сеюэ Севетенмв
Сецмалнетнчеенма
Республик
G 01 и 33/48
3ЪвударетшпаЯ комитет
CCCP ао делам лэабретеклЯ я открытий (53) УДК б1б 07 (088.8) Опубликовано 15.07.82. Бюллетень М 26
Дата опубликования описания 15.07,82 (72) Авторы изобретения
Н. В. Серов, А. С. Берлянд, А. 3. Книжник и Ю. Б. Волькенштейн (54) СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ
МЕБИКАРА В БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЯХ
Изобретение относится к медицине, в частности к исследованию биологических жидкостей.
Известен способ количественного определения мебикара в биологических жидкостях путем
5 обработки пробы органическим экстрагентом с последующим анализом экстракта методом газо-жидкостной хромотографии (1) .
Известный способ обладает малой чувствительностью (0,5 мг/мл), недостаточной для on- >0 ределения мебикара в биологических жидкостях человека, высокой трудоемкостью, длительностью выполнения. Применяемое сложное оборудование недопустимо для большинства клинических лечебных учреждений.
Цель изобретения — ускорение и повышение чувствительности способа.
Эта цель достигается тем, что в способе количественного определения мебикара в биологических жидкостях путем обработки органн- эо ческим экстрагентом с последующим анализом экстракта методом газо-жидкостной хроматографии, отличительной особенностью является то, что в качестве экстрагента используют хлороформ в соотношении 1:15-25, а в качестве хроматографического стандарта — 2,4,5,7, 8,10- гексаметил-2,4,8,10-тетраазобицикло (4,4,0) декандион-3,9.
Способ осуществляют следующим образом.
Мебикар экстрагируют нз образца биологической жидкости 20-кратным объемом хлороформа 10 мин, разделяют слои, и экстракт упаривают. Сухой остаток растворяют в соответствующем количестве 005%-ного хлороформного раствора стандарта, определяемого по табл. 1.
Хроматографируют пробу при следующих условиях.
Хроматограф газо-жидкостной ЛХМ-8МД, модель 5. Детектор пламенно-ионниэационный, чувствительность по пропану 5 ° 10 6. Масштаб регистрации 1/100.
Колонка применяется длиной 1 м с внутренним диаметром 3 мм из нержавеющей стали; заполненная 3У 01 -17 на хромосорбс
"9" (готовая коммерческая фаза" фирмы
"Chemapo1" (ЧССР) . Кондиционирование колонки осуществляется нагреванием до 260 в рег. ф
943571
3 жиме программирования в течение полутора часов и дальнейшим выдерживанием при этой температуре 8 ч в токе азота. Температура испарителя 250 Ñ. Температура колонки 240 C.
Режим изотермический. Газ-носитель — азот.
Скорость на выходе из колонки 30 мл/мин.
Вспомогательные газы: воздух — 300 мл/мин, водород —. 35 мл/мин. Растворитель хлоро-. форм. Концентрация растворов 0,05%. Время удерживания мебикара — 1 мин. 50 с. Внутренний стандарт 2,4,5,7,8;10-гексаметил, 2,4,8,10тетраазабицикло (4,4,0) декандион-3,9. Время движения ленты самописца — 240 мм/ч.
Получение количественных данных. Для нахождения относительных калибровочных коэффициентов мебикара по стандартному веществу готовят смеси с точно известным, содержанием мебикара и стандарта в соотношениях 650:500, 500.500 и 350:500 н хроматографируют. В используемом узком диапазоне сигнал детектора является линейным как по определяемому, так и по стандартному веществу. Относительная ошибка определения по данным анализа калибровочных смесей составляет
2,4 - 3,3% (f=6; Р= 0,95) .
В качестве параметра для расчетов пиков используют высоту (Н). Отсчет производят линейкой с точностью до 0,1 мм.
В табл. 1 приведено количество 0,05% хлороформного раствора стандарта, необходимое для растворения сухого остатка.
Содержание мебикара в пробе для хроматографнрования не зависимо от исходной концентрации мебикара в бножидкости равно содержанию стандарта и одной и той же величине.
Добавляя стандарт таким образом нет необходимости в корректировке количества вводимой пробы и масштаба регистрации детектора. Исключается влияние искажений, связанных с нелинейностью сигнала детектора по определяемому и стандартному веществам, отсутствует необходимость в периодической проверке калибровочных коэффициентов в широком диапазоне. Чувствительность анализа составляет
10-8 r. Возможные примеси, содержащиеся в хлороформных экстрактах, не влияют на форму пиков и времена удерживания хроматографируемых веществ.
Пример 1, Количественное определение мебикара в моче человека (искусственные смеси). Готовят точные растворы мебикара в моче в концентрациях, указанных в табл. 2.
Дезактивнруют ферменты нагреванием на кипящей водяной базе 5 мин 2 мл приготовленной искусственной смеси помещают в ци. линдр на 60 мл с притертой пробкой, закрепляют на шейкере в наклонном положении и экстрагируют 10 мин. Водный слой удаляют
$5
1 отсасыванием. Хлороформную фракцию отго- няют иа роторном испарителе под вакуумом водоструйного насоса приблизительно до объема в 2 мл и фильтруют экстракт через воронку со стеклотканью в микрофлакон на 5 мл, Дополнительно омывают стенки цилиндров 2 мл хлороформа и добавляют их через фильтр K экстракту. Экстракт упаривают досуха в токе азота. Сухой остаток растворяют в 0,5%-ном хлороформном растворе стандарта, как указано в табл. 1. 1 мкл
I полученного раствора вводят микрошприцом в испаритель хроматографа. Измеряют отношения высот пиков мебикара и стандарта. Содержание мебикара вычисляют по формуле
А = Х К 100, где А — содержание мебикара в мкг;
Х вЂ” коэффициен1, кратный опредсляемым конпентрациям мебикара;
К - относительный калибровочный коэффициент.
В табл. 2 приведены результаты определения мебикара в моче (искусственные смеси).
Пример 2. Количественное определение мебикара в плазме крови человека (искусственные смеси). Получают плазму из крови донора, содержащей 5% (по объему) 10%-ного раствора цитрата натрия, центрифугированием
10 мин при 3000 об/мин. Готовят точные растворы мебнкара в плазме крови в концентра циях, указанных в табл. 3. 2 мл приготовленной искусственной смеси помещают в цилиндр на
60 мл с притертой пробкой и далее поступают, как описано в примере 1. Результаты определений приведены в табл. 3.
Пример 3. Количественное онределение мебикара в моче человека (больной Катасонов Ю. А., 43 года). Отбирают образцы мочи до приема мебикара (контроль) и в течение трех суток после приема разовой дозы 0,6 г (перорально). Деэактивируют ферменты нагреванием на кипящей водяной бане 5 мин 2 мл каждого образца помещают в цилиндр с ритертой пробкой и далее поступают, как описано в примере 1. Для коррекции количества, стандарта, необходимого для растворения сухого остатка, проводят по 2 параллельных определения каждого образца мочи.
Результаты определений мебикара в моче больного приведены в табл, 4.
Данные в табл. 4 показывают, что предлагаемый способ позволяет определять содержание мебикара в моче человека, начиная с момента введения и кончая элиминацией из организма.
При лабораторных испытаниях предлагаемо4 го способа выявлены следующие преимущества по сравнению с известным способом: чувствиТаблица l фактические измеряемые концентрации мебикара и стандарта в хроматографируемой пробе, мкг/мл
Содержание мебикара в биожидкостях
Количество добавленного 0,05%-ного раствора стандарта
1 мл мкг в 1 мл в2мл 300
1,2
0,8
0,4
0,2
100
50
0,1
0,05
12,5
0,025
6,25
12,5
12,5
Таблица .2
Содержание мебикара в
1 мл. мочи, мкг
Найдено мебикара, % мкг
267,1
89,02
0,93
2,3
2,5%
176,3
88,14
0,76
1,9
2,1%
86,78
100
86,78
0,54
1,3
1,5%
42,36
84,72
1,0
2,5
2,9%
20,66 82,64
0,83
2,0
2,4%
12,5
10,16
81,31
1,9%
0,64
1,6
6,25
4,69
75,16
3,1
4,1%
5 943571 тельность определения повышается в 5 ° 10 раз; извлечение мебикара иэ жидкостей выше в среднем повышается на 5 — 10%; время анализа сокращается в два раза; вместо хлористого метилена используется менее токсичный хлороформ; анализ упрощается благодаря применению доступного метода газовой хроматографии вместо протонной магнитной резонансной спектроскопии. Использование предлагаемого
d способа определения мебикара в биологических жидкостях по сравнению с известным способом обеспечивает воэможность определения мебикара в биологических жидкостях с высокой воспроизводимостью полученных данных, что важно для изучения фармакокинетики мебикара и позволяет уменьшить время, затрачиваемое на анализ, использовать доступное оборудование.
Метрологические характеристики при =6, P =095
943571
Содержание мебикара в плазме крови, мкг
1,71
0,72
2,1
82,40
247,2
0,66
2,0
1,62
80,76
161,5
79,28
2,0
l,62
0,66
79,28
1,9
0,79
76,95
38,47
18,50
2,1
74 01
0,93
0.71
0,52
0,27
73,68
9,21
12,5
3,87
70,93
1,26
4,43
6,25
Конце мг/мл намеренная
0,000
0,000
150
0,000
250
16,08
2,83
0,057
О 067
5,22
0,056
0,066
370
24,42
47,32
8,08
0,306
0,364
130
0,387
О,) 73
200
96,75
34,60
13,09
0,077
0,065
170
26,83
0,059
0,070
22,40
0,044
0,052
220
6,76
0,045
0,053
1),66
0,038
0,032
36,50
7,60
0,017
180
О 015
45 00
З,06
230
0,007
0,006
0,000
49,10
1,61
180
0,000
51,20
0,00
Всего.450.01
Время с момента 1 приема мебикара
11,66
20,08
23,91
29,67
32,91
0,326
0,146
Найдено ме6икара, Таблица 3
Метрологи )еские характеристики при f 6, Р 0,96
Таблица 4
Суммарное содержание в обраэце мочи
943571
Формула изобретения
Составитель Л. Донцов
Редактор М. Парфенова Техред M. Рейвес . Корректор А. Гриценко
Заказ 5097/49 Тираж 887 Подписное
ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий
113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5
Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4
Способ количественного определения мебикара в биологических жидкостях, путем обработки пробы органическим зкстрагентом с по- S следующим анализом экстракта методом газожицкостной хроматографии, о т л н ч а io шийся тем, что, с целью ускорения и повышения чувствительности способа, в качест10
Se зкстрагента используют хлороформ в соотношении 1:15-25, а в качестве хроматографического стандарта — 2,4,5 7,8,10-гексаметил2,4,8,10-тетрааэобицикло (4,4,0) декандион-3 9.
Источники информации, принятые во внимание при экспертизе
1. Бочкарева О. М. Химико-фармацевтическое изучение нового транквилизатора мебикара.
