Способ получения тромбиноподобных ферментов

 

Союз Советских

Социалистических

Республик

О П И С А Н H Е (п)946389

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

К ПАТЕНТУ (61) Дополнительный к патенту (22) Заявлено 15.08.77 (21) 2510853/28-13 (23) Приоритет — (32) 17. 08. 76 (31) 10493/76 (88) Швейцария (51) М. Кл.

A 61 K 35/58

Гасударственный комитет

СССР (53) УДК 615.45:

:615.94 (088.8) Опубликовано 230782 Бюллетень № 27 ао делам нзобретеннй и открытий

Дата опубликования описания 25. 07. 82, (72) Автор изобретения

Иностранец

Курт Ф. Штоккер (Швейцария) /

;.. Г

Иностранная фирма

"Пентафари АГ" (Швейцария) (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТРОМБИНОПОДОБНЫХ

ФЕРМЕНТОВ

Изобретение относится к химикофармацевтической промышленности и касается получения тромбиноподобных ферментов, которые находят применение в качестве реактивов для изучения процессов .свертывания крови, в качестве противогеморрагических лекарств и в качестве средств для экспериментального и терапевтического дефибриногенирования. l0

Известен способ получения тромбиноподобных ферментов путем хроматографии змеиного яда (1 ).

Однако известный способ является трудоемким и неэкономичным, так как позволяет хроматографировать лишь небольшие количества сырого яда на относительно больших колоннах.

Цель изобретения - упрощение способа. 20

Эта цель достигается тем, что согласно способу получения тромбиноподобных ферментов путем хроматографии змеиного яда, змеиный яд в водном растворе или в буфере рН 4- 10 25 с содержанием 0,01-0,5 моль на литр хлористого натрия обрабатывают гепарином, иммобилизированным через аминогруппы на инертном носителе, и выделяют целевой продукт.

В качестве исходного вещества для осуществления способа пригодны водные растворы, центрифугированные или отфильтрованные до прозрачности сырого змеиного яда змей семейства

Grotidae, в частности видов Agkistrodon Bothrops Crota Eus Trimeresu rus, можно использовать и фракции змеиных ядов, центрифугированные или отфильтрованные до прозрачности, содержащие тромбиноподобные ферменты в обогащенном виде, и из которых балластные вещества удалены осаждением кислотой или термической обработкой, могут быть также использованы сырые препараты тромбиноподобных ферментов змеиных ядов, полученных осаждением фенола или его производным из сырого яда.

zo з 9ч638

Нерастворимый гепарин можно получить взаимодействием гепарина известным способом через его аминогруппы с реакционноспособными группами полимерного нерастворимого в воде

5 вещества — носителя, связывая его, тем самым, ковалентно с носителем.

Нерастворимый гепарин можно, например, получить предлагаемым способом путем связывания гепарина

1О с агарозой по цианогенбромидному методу, путем связывания с путресцинагарозой.:по тифосгеновому методу или путем связывания с эпсилонаминокапроилагарозой по карбоди15 имидному методу..

В качестве носителя можно приме.нять и целлюлозу и ее соответствующие производные, т.е. путресциновую и эпсилонаминокапроилцеллюлозу. Нерастворимый гепарин целесообразно получать и путем взаимодействия гепарина с поперечно сшитой цианогенбромидной агарозой в виде шариков или бусин стандартной величины.

Обработку исходного материала нерастворимым гепарином (т.е. связывание тромбиноподобного фермента змеиного яда с гепарином) и отщепление фермента из нерастворимого гепарина

30 можно вести по порциям путем размешивания исходного материала, растворенного в воде, водном буферном растворе, водном растворе электролита без буферного действия или, в крайнем случае, с небольшим буферным действи- 3 ем или же содержащем как буфер, так и нейтральную соль, например хлористый натрий, вместе с родственным адсорбентом (т.е. нерастворимым гепарином) с последующей фильтрацией, или же, предпочтительно, хроматографией по химическому родству на колонне.

В качестве электролитов пригодны неорганические и органические соли, например хлористый натрий, хлористый аммоний, сульфат магния, сульфат аммония, ацетат натрия, хлористый кальций, бикарбонат аммония, формиат аммония, триэтиламингидрохлорид; или же органические кислоты, как например уксусная, винная или лимонная; или же основания, как например гидроокись аммония, триметиламин, триэтиламин. При хроматографии по химическому родству нерастворимый гепарин заливают s кKоoл оoнHнHу, диаметр которой coosветствует примерно одной десятой ее высо1ы, и эквилибрируют

9 ф той же водной средой, в которой растворен исходный материал. На выходе из колонны целесообразно установить фотометрический расходомер, измеряющии и автоматически записывающий оптическую плотность выходящих элюатов при надлежащем диапазоне волн (280 или 254 нм). Элюаты, предпочтительно, разбивают на фракции посредством автоматического коллектора фракций и собирают.

Хроматографию по химическому родству ведут следующим образом. Исходный материал (сырой змеиный яд или его фракцию) растворяют в воде, водном буферном растворе или водном растворе электролита, например растворе хлористого натрия, или же водном растворе, содержащем как буфер так и нейтральную соль, например хлористый натрий. Раствор фильтруют до прозрачности или центрифугируют и затем заливают в колонну. Колонну до тех пор промывают той же водной средой, что и та, в которой растворен исходный материал, до тех пор, пока в выходящем элюате больше нельзя обнаружить поглощающие Уф-лучи вещества. Затем колонну промывают водным алюентом, например буферным раствором или электролитным раствором или раствором, содержащим как буфер так и нейтральную соль, например хлористый натрий, концентрация которого превышает таковую водной среды, в которой растворен исходный материал, с целью отщепления тромбиноподобного фермента змеиного яда от нерастворимого гепарина. Промывают до тех пор, пока не элюируется поглощающее УФ-лучи вещество. Затем промывают еще раз буферным раствором, раствором электролита или раствором, содержащим как буфер, так и нейтральную соль, например хлористый натрий, отличающимся концентрацией, достаточной для удаления без остатка из колонны веществ, более сильно связанных с нерастворимым гепарином, чем тромбиноподобные ферменты, так что после осаждения адсорбент по родству снова можно регенерировать и использовать для нового процесса.

В качестве буферных растворов пригодны водные растворы солей неорганических или органических оснований с неорганическими или органическими кислотами или же соли амфо46389

5 9 терных веществ, развивающих буферное действие в пределах рН 4-10. В частности, пригодны нетоксичные вещества или их смеси, не содержащие ароматических групп и поэтому не поглощающие свет дпиной волн 280 или

254 нм и которые тем самым, не мешают проведению УФ-фотометрического контроля процесса хроматографии, в частности буферы на основе глицина

/гидроокиси натрия, уксусной кислоты; гидроокиси натрия, лимонной кислоты/ гидроокиси натрия, триэтаноламина соляной .кислоты, лизина./ соляной. кислоты, глицилглицина/соляной кислоты, фосфата натрия, а также летучие в вакууме буферные системы как буферы на основе формиата аммония, ацетата аммония, этилендиаминтетраацетата.

Для применения в прерывистом способе далее пригодны буферы на основе гидрокарбоната натрия, гидрокарбоната аммония, однако они для хроматографических операций непригодны из-за выделения СО . Тромбиноподобные ферменты из различных змеиных ядов обладают разным родством к нерастворимому гепарину, связанному нерастворимым наполнителем. В соответствии с этим состав буферов биологического происхождения следует согласовывать с выделяемыми ферментами.

5 зо

25 зо

4ем меньше концентрация буферного или электролитного раствора или раствора буфер-нейтральная соль, тем лучше фермент связывается с нерастворимым гепарином.

Однако при низкой концентрации максимальной является неспецифическая способность гепарина связывать белки, концентрации надо подбирать такими, при которых связывается тромбиноподобный фермент, остальные же белки проходят через колонну без задержки. Для каждого отдельного яда оптимальные условия по концентрации могут быть определены простыми предварительными экспериментами.

Связывание всех исследованных тромбиноподобных ферментов из змеиных ядов происходит при концентрациях буферных растворов или электролитных растворов или растворов буфер-нейтральная соль в пределах диапазона молярности 0,01-0,5 и рН 4- 10 в зависимости от рода яда.

6

Для отщепления тромбиноподобных ферментов из змеиных ядов, связанных с нерастворимым гепарином, применяют буферные растворы или электролитные растворы или растворы буфернейтральная соль, обладающие более высокой концентрацией, чем раствор, используемый для связывания фермента к нерастворимому гепарину. Предпочтительно применяют тот же раст-: вор буфера, что и для связывания фермента к нерастворимому гепарину, однако концентрацию его повышают путем добавления сильно диссоциирующей соли нейтрального характера, предпочтительно хлористого натрия, таким образом, что связанный фермент отщепляется от нерастворимого гепарина.

Поскольку в некоторых змеиных ядах содержатся и другие вещества с родством к нерастворимому, гепарину, концентрацию используемого для элюирования раствора, предпочтительно, доводят до значения, при котором тромбиноподобный фермент отщепляется, другие же вещества с более сильным родством остаются связанными с нерастворимым гепарином.

Отщепление всех связанных с нерастворимым гепарином тромбиноподобных ферментов из змеиных ядов проводят предпочтительно при концентрациях диапазона от 0,1-2 молей и при рН диапазона 4-10.

Удаление всех связанных с нерастворимым гепарином компонентов ядов с родством к гепарину, превышающим,таковое тромбиноподобных ферментов, целесообразно проводить с применением буферных растворов или растворов электролита или растворов буфер/нейтральная соль, с молярностью 0,5-2 и диапазоном рН 4-10.

Предпочтительно концентрацию первого буферного раствора, используемого для связывания фермента, и нерастворимый гепарин, доводят путем добавления нейтральной соли, предпочтитель но хлористого натрия, до желательного значения. Адсорбент переводят в рабочее состояние путем промывки первым буферным раствором, использованным для связывания фермента с нерастворимым гепарином.

Родство нерастворимого гепарина к тромбиноподобным ферментам из змеиных ядов при низкой температуре мак946389

40 симально и снижается с повышением температуры. Это явление можно использовать для инициирования связывания фермента к нерастворимому гепарину при низкой температуре, например в охлаждаемой ледяной водой колонне, равно как и отщег:пения фермента повышением температуры в охлаждающей или обогревательной рубашке колонны, например до 40 С, с применением to о одного единственного буферного раствора постоянной концентрации и постоянного значения рН.

Отщепление фермента от нерастворимого гепарина осуществляют при пос- 1 тоянной концентрации водной среды на буфере и/или нейтральной соли путем повышения или снижения значения рН выше или, соответственно, ниже такового, при котором происходит связывание фермента с нерастворимым гепарином. рН для каждого фермента определяют проведением простых предварительных опытов.

Содержание тромбиноподобного фермента из змеиного яда в элюатах, полу ченных при хроматографии на колонне, определяется опытом по свертыванию, предпочтительно на фибриногене.

В качестве опыта по свертыванию пригодно, например, определение времени свертывания в секундах по добавлении,0,2 мл разбавленного элюата к 0,2 мл 0,4l-ного фибриногена (крупного рогатого скота) при рН 7,4 и

37 С. Простое определение времени свертывания пригодно для получения графика профиля активности в виде кривых элюирования. По той же технике с применением тромбинового стандартного препарата или с применением стандартного препарата для данного тромбиноподобного фермента из змеиного яда калибровочной кривой активности можно получить из време4S ни свертывания в количественных данных,(единицы Na t i ona 0 I ns t tu te of

Heatth (NIН) или единицы Ancrod или единицы Batroxobin) .

Содержание тромбиноподобного

so фермента можно определить и фотометрическим путем с применением синтетического хромогенового тромбинового субстрата, например Tos-Gly-ProArg-pNA.НС1 в ферментных единицах.

Одна единица (U) в таком случае обозначат количество фермента, отщепляющее в условиях опыта в течение

1 мин и 1 м моль субстрата.

Из собранных активных фракций затем удаляют нежелательные буферные вещества и соли путем диализа полностью или частично. Одновременные обессоливание и концентрацию собранных активных фракций осуществляют ультрафильтрацией, например с применением мембраны Diaf to-Membran UM-2.

Необходимость обессоливания и концентрации фракции, содержащей тромбиноподобный фермент из змеиного яда, зависит от рода применяемого буфера, обработанного хроматографией количества вещества и назначения продукта. При использовании нетоксичных буферных систем, как например глицина /NaOH/NaCf для получения тромбиноподобных ферментных препаратов для экспериментального и/или терапевтического дефиброгенирования для возможности получения из собранных активных фракций элюата известными способами изотонического стерильного, не содержащего . пирогена раствора, требуется только частичное обессоливание или же его не требуется вовсе. Частичное обессоливание является достаточным и в том случае, когда содержащийся в элюате тромбиноподобный фермент змеиного яда нужно повторно хроматографировать с целью дальнейшей очистки, в таком случае достаточно доведение концентрации буфера или соли элюата до более низкого значения, необходимого для связывания по химическому родству, чтобы фермен оказалось возможным снова связать с нерастворимым гепарином.

Пример 1. 9 г гепарин-натрия специфической биологической активности 162 международных единиц на мг растворяют в 1 л 0,1-молярного натрийбикарбонатного буфера, содержащего 0,5 моля/л хлористого натрия и рН которого равняется 8,3. В раствор добавляют 45 г CNBr-сефарозы 4В, которой перед тем дают набухнуть и очиститься в 0,001 н соляной кислоте. Смесь 2 ч перемешивают. По окончании реакции смесь фильтруют на стеклянном нутче типа G-3, отфильтрованный продукт сефароза-гепарин промывают пять раз натрийбикарбонатным буфером указанного состава по 300 мл. Для насыщения еще содержащихся реакционноспособных групп CNBr сефарозу-гепарин 2 ч

30

9 9" перемешивают вместе с 1 л О, 5..,— ного этаноламина в натрийбикарбонатном буфере указанного состава. Затем сефарозу-гепарин снова собирают на стеклянном нутче и еще трижды промывают натрийбикарбонатным буфером по 300 мл. После этого сефарозу-гепарин до тех пор домывают

0,1-молярным натрийацетатным буфе- ром рН 4,0, пока рН фильтрата не будет доведен до 4,0. Наконец, ставший нерастворимым гепарин .промывают несколькими порциями 0,1-молярного глицина /NaOH-буфера рН 8,5; заполняют в колонну диаметром 26 мм и осаждают тем же самым буфером на основе глицина /гидроокиси натрия.

Колонну затем переналаживают на нисходящую хроматографию, высота колонны 29 см, тем самым содержание нерастворимого гепарина равняется примерно 153 мл. Выход из колонны подключают через фотометрический расходомер, настроенный на измерение волн диапазона 280 нм и оснащенный автоматическим самописцем, к сборнику фракций, установленному на сбор фракций по 350 капель.

30 г яда змеи Bothrops atrox растворяют в 600 мл дистиллированной воды. Значение рН раствора доводят до 3,0 с помощью 1-н хлористого водорода и по истечении одного часа инкубационного процесса до 7,3 с помощью 1-н гидроокиси натрия. Полученный при этом продукт в виде хлопьев отделяют центрифугированием и выбрасывают. В остаток, добавляют раствор 15 г натрийсалицилата в 300 мл дистиллированной воды. рН раствора доводят до

3,0 с помощью 1-н хлористого водорода. По истечении 60 мин образовавшийся осадок удаляют центрифугированием, растворяют в 200 мл 0,1-молярного буфера на основе глицина, гидроокиси натрия со значением рН

8,5 и до тех пор промывают этим буфером на ультрафильтре, пока по добавлении хлористого железа — (1!!) х-âàëåíTHorо проба фильтрата не будет окрашиваться в фиолетовый цвет, т.е. не будет более содержать салициловой кислоты.

Оставшийся на фильтре концентрат в количестве около 30 мл обрабатывают 0,1-молярным буфером на основе глицина/гидроокиси натрия со значением рН 8,5 до достижения объема

6389 10

50 мл. Содержание батроксобиновых единиц (В0) на мл составляет в таком случае 2240, продукт загружают .в подготовленную колонну из сефарозы- гепарина. Прополаскиванием 750 мл

0,1-молярного буфера на основе глицина/гидроокиси натрия со значением рН 8,5 (буфер 1) элюируют балластные вещества. Затем колонну элюируют

0,1-молярным буфером на основе глицина-гидроокиси натрия со значением рН 8,5 (буфер Il), содержащим

0,1 моль/л хлористого натрия, до тех пор, пока не пройдет 1120 мл жидкости, при этом снова удаляют элюированием балластные вещества. После этого тромбинообразный фермент улавливают в виде двух абсорбирующих

Уф-лучи коагулирующих фибриноген зон путем элюирования с применением

0,1-молярного буфера на основе глицина/гидроокиси натрия со значением .рН 8,5 (буфер III), содержащего

0,25 моля/л хлористого натрия, до количества протекающей жидкости

900 млн.

Наконец, путем элюирования с применением 600 мл буфера на основе глицина/гидроокиси натрия со значением рН 8,5 (буфер IV) содержащего

1 моль/л хлористого натрия, удаляют вещества, оставшиеся связанными с сефарозой-гепарином.

Тромбиноподобный фермент (батрак собин) содержится в 800 мл элюата

s концентрации 100 батраксобиновых единиц на мл. Выход в пересчете на нанесенные 112 000 батраксобиновые единицы (BU) составляет 71,43. Элюат концентрируют на ультрафильтре (Diаf fomembran 0И-2 Ami con) на 80 мл, после чего он служит в качестве концентрата батроксобина для получения фармацевтического препарата с содержанием батраксобина в объеме 22 единиц на миллилитр для терапевтического дефиброгенирования.

Пример 2. 0,1 г яда змеи вида Agkistrodon contortrix растворяют в 1,5 мл водного 0,1-молярного буфера на основе глицина/гидроокиси натрия при рН 6,0. Раствор загружают в колонну (17х70 мм, 16 мл) из гепарин-сефарозы. Колонну домывают тем же буфером до тех пор, пока сливаемая промывная жидкость при 280 нм.

6389 12 целях удаления балластного материала

0,01-молярным глициновым буфером со значением рН 6,0, содержащим 0,25 моля хлористого натрия на литр. Получают 120 мл этого раствора с содержанием 27 единиц Anorod на миллилитр.

Этот продукт показывает при электрофорезе на полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия

0 одну единственную зону.

11 94 не показывает поглощения света. Затем колонну пропопаскивают 0,1-молярным глициновым буфером со значением рН 6,0; содержащим 0,75 моля хлористого натрия на литр, до тех пор, пока из колонны больше не вымывается какое-либо количество поглощающего Уф-лучи продукта. Этот содержа— щий балластные продукты элюат выбрасывают. Затем путем элюирования с применением 0,1-молярного глицинового буфера со значением рН 6,0 и содержащего t,0 моля хлористого натрия на литр выделяют тромбинообразный фермент. Получают 22 мл элюата с коагулирующим действием на фибриноген. Согласно измерению на синтетическом хромогенном субстрате (бензоил-Рго-Phe-Arg-И-нитроанилиде) активность в общей сложности составляет 6996 миллиединиц. Общее процентное содержание активного элюата составляет 6,2. Очищенный таким образом тромбинообразный фермент из яда змеи Agkistrodon contortrix показы- 25 вает при электрофорезе на полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия одну единственную зону; при испытании на ненагретой фибриновой пластине обнаруживают отсутствие фибринолитической активности. Затем концентрируют на ультрафильтре (Diaf gomembran UN-2, Amicon) до обьема 1-2 мл. В концентрат добавляют 150 мг дактозы, затем. разбавляют дистиллированной водой до 30 мл, разливают по пузырькам объемом в 1,0 мл и лиофилизируют.

Получают 30 пузырьков с содержанием каждый по 200 миллиединиц фермента в виде стабильного сразу же растворяющегося продукта. В этом виде препарат пригоден для исследования фибриноген-фибринового превращения в физиологических и патологических условиях.

Предлагаемый способ позволяет на колонне для хроматографии объемом всего лишь 20 мл расщепить более

4 г сырого яда или эквивалентное количество предварительно очищенной фракции фермента, причем образуются тромбиноподобные ферменты высокой степени чистоты. Это соответствует приблизительно 40-кратной производительности ионообменной хроматографии на целлюлозных обменниках, примерно 400-кратной производительности гель-хроматографии и примерно

25-кратной производительности хроматографии по химическому родству на и-аминобенз-амидин-сукцинил-диаминодипропиламиноагарозе. Эта сильная способность образовывать связи нерастворимого гепарина не только повышает производительность расщепления относительно небольшого устройства для хроматографии, но и обеспечивает то, что активные фракции элюата содержат фермент в значительно более высоких концентрациях по сравнению с ионообменной гельхроматографией, вследствие чего значительно сокращается трудоемкость операций концентрирования и обессоливания элюатов. Согласно предлагаемому способу тромбиноподобные ферменты из змеиных ядов получают за небольшое число операций, легко проводимых, в большой степени автоматизирующихся и хорошо регистрируемых. Применение токсичных элюентов не нужно.

Пример 3.0,1гядазмеи вида Agkistrodon rnodostoma растворяют в 1,5 мл водного 0,01-молярного глицинового буфера со значением рН 6,0. Раствор загружают в колонну (17х70 мм, 16 мг) из гепарина-сефарозы, осажденную тем же буфером.

Затем ее промывают тем же буфером до тех пор, пока с помощью фотометрического расходомера в элюате больше нельзя обнаружить поглощающий УФ-лучи продукт. Затем колонну элюируют в формула изобретения

Способ получения тромбиноподобных ферментов путем хроматографии змеиного яда, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа, змеиный яд в водном растворе или в буфере рН 4-10 с содержанием 0,01

0,5 моль на литр хлористого натрия. обрабатывают гепарином, иммобилизи15 94638 рованным через аминогруппы на инертном носителе,и выделяют целевой продукт .

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

9 14

1. Ho Heman ап4 We i ss. Extraction

and Isolation of Thromb1nfike Enzymes. J. Вiof Chem. 1976, 252, 1663- 1669

Составитель С. Малютина

Редактор В. Данко Техред Т.фанта Корректор 4 ГРиценко

Заказ 535 /7 Тираж 71 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная,