Способ определения активности аминоацилазы
ОЛ ИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕН ИЯ К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ Союз Советских Социалистических Республик (61) Дополнительное к авт; свид-ву— (22) Заявлено 11.12.80 (21) 3215990/28-13 с присоединением заявки №вЂ” (23) Приоритет— (51) М.К . С 12 N 9/78 G 01 N 31/00 Гееударстеенкме камитет llo делам иэебретенкй И OTNPhlTHH Опубликовано 23.10.82. Бюллетень №39 (53) УДК 577.15..07 (088. 8) Дата опубликования описания 28.!0.82 (72) Авторы изобретения И. Г. Вейнберга, Д. Я. Лауцениеце, А. А, Ха и А. К. Арен (71) Заявитель (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ АМИНОАЦИЛАЗЫ Изобретение относится к области аналитической химии, а именно к способу определения активности фермента аминоацилазы, который широко применяется для разделения рацемических смесей N-ацетил-DL-аминокислот. Полученные 1;аминокислоты находят применение E пищевой и химической промышленности, в сельском хозяйстве и медицине. Известен спектрофотометрическнй метод определения активности аминоацилазы. Способ основан на измерении изменения интенсивности поглощения субстрата и продукта реакции при 238 нм (1). Недостатком этого способа являются ограничение койцентрации субстрата (0,025 М) и необходимость использования дорогостоящей и сложной аппаратуры. Известен также нингидриновый способ определения активности аминоацилазы, заключающийся в инкубации фермента с субстратом-N-ацетил-D, L-метионином при 37 С в течение 30 мин с последующим прекращением ферментативной реакции в результате выдерживания реакционной смеси в течение 30 мин при 100 С и определением количества выделившейся в. результате реакции L-аминокислоты. 1=аминокислоту определяют по ее способности образовывать с нингидрином продукта фиолетово-синего цвета измерением оптической плотности при Л = 570 нм. Количество освободившейся L-аминокислоты находят по калибровочной кривой (2). Известный метод достаточно чувствителен, однако его недостатками является большое количество промежуточных операций, в результате чего возрастает общая длительность и трудоемкость анализа (время— 95 мин, количество операций — 9). Кроме того, недостатком известного способа является ограниченность концентрации (не выше 1 10 4М) определяемой 1=аминоls кислоты, что обуславливает необходимость разбавления пробы в 50 †1 раз и увеличивает ошибку определения. Целью изобретения является упрощение процесса, сокращение времени анализа и 20 расширение области применения способа. Поставленная цель достигается тем, что согласно способу определения активности аминоацилазы, включающему инкубацию фермента с N-ацетил-D, L-метионином, прекращение ферментативной реакции деаце968070 тилирования N-ацетил-D, L-аминокислоты и определение количества выделившейся L-аминокислоты, причем инкубацию фермента проводят при содержании субстрата в смеси (5 — 25) 10 М/мг белка, прекращение реакции деацетилирования осуществляется до- ь бавлением в реакционную смесь 5 — 20-кратного избытка формалина, а количество выделившейся 1;аминокислоты определяют потенциометрическим титрованием до значения рН 85+- 0,01. Предлагаемый способ значительно сокращает время анализа (от 95 мин до 20 мин) и упрощает его (вместо 9 операций — 5). На чертеже изображена кривая потенциометрического титрования реакционной смеси после гидролиза N-ацетил-D, L-метио- 15 нина аминоацилазной стандартным раствором гидроокиси калия. Происходящее в результате реакции увеличение оптимальной концентрации аминокислоты в пробе дает возможность применять этот метод с точностью 4-3 /о при контроле производственных процессов разделения рацемических смесей N-ацетил-D, 1;аминокислот, где обычно применяются 0,5 — 1 М Искусственная смесь Аминокислота 1-Аминокислота Ацетил-D-аминоАцетил-DL-амино кислота Ацетат натрия В 4 в М кислота 0,25 0,25 0,25 0,20 0,20 0,15 0,15 0,10. 0,10 0,195 97,65 0,146 97,24 0,20 0,30 0,15 0,35 0,10 0,45 О, 0486 97, 19 0,05 0,05 0,05 Титруют 0,01 М раствором гидроокиси калия до рН 8,5. Параллельно проводят холостой опыт (без фермента). Активность ацилазы в мкМ мин/мг вычисляют по .формуле 50 (Võ — Vo) и Vp 10 л= t. t где А — активность, ед/мг (за единицу активности аминоцилазы принимают количество фермента, катализи55 рующего деацетилирование одного микромоля N-ацетил-D, L-метионина в одну минуту при температуре 37 С и рН 7,2 в 0,1 М фосфатном буфере); В качестве титранта рекомендуется использовать примерно 0,01 н. водный раствор сильного основания, например гидроокиси калия и натрия, Оптимальная концентрация аминокислоты в пробе от 0,05 — 0,25 М,,что составляет расход титранта при титровании одного мл анализа примерно от 5 до 25 мл. В анализах с небольшим количестком 1;аминокислоты следует увеличить объем анализа. Определение L-аминокислоты заключается в следующем: к 1 мл реакционной смеси, содержащей 5 — 25.10 М 1=аминокислоты, добавляют 5 — 20 мл формалина, нейтрализованного до рН 7,0, и 20 мл дистиллированной воды. субстраты. В результате исключается многократное (50 †1 раз) разбавление пробы. Определение L-аминокислоты предусматривает, что раствор, содержащий 1;аминокислоту, обрабатывают формалином. Формалин разрушает беатиновую структуру 1;аминокислоты и освобождаются карбоксильные группы, которые можно оттитровать щелочью. сня R - СН-СОО R CH — COOH I+ l з ян, си,о Но кривым потенциометрического титрования установлено, что 1;Ы-аминокислота количественно оттитруется до рН 8,5. Для доказания пригодности метода сделана серия экспериментов с искусственными смесями, содержащими 1;аминокислоту, натриевые соли N-ацетил-D,1=àìèíîêèñëîòû и N-ацетил-D-аминокислоты и также ацетат натрия, что соответствует различным степеням гидролиза N-ацетил-D,L-аминокислоты. Искусственные смеси с разными концентрациями компонентов обрабатывали формалином и оттитровали щелочью до рН 8,5. Результаты даны в таблице. 0,25 0,246 98,35 0,40 0,982 98, 19 968070 Ч» — объем КОН, израсходованный для титрования в опыте, мл; Vo — объем КОН, израсходованный для титрования холостого опыта, мл; п — точная концентрация КОН, М; Vp — общий объем реакционной смеси, мл; t — время инкубации, мин; с1 — количество фермента, мг. Пример 1. В термостатированную ячейку к 10 мл 0,1 М N-ацетил-D,1=ìåòèîíèíà, нагретого до 37 С, при перемешивании добавляют 0,2 мл раствора ацилазы (содержание бел- >Р ка 2,06 мг) в 0,1 М фосфатном буфере (рН 7,2), выдерживают в течение 10 мин. Автоматической пипеткой отбирают 1 мл реакционной смеси и помещают в стакан для титрования (Ч = 50 мл), содержащий 5 мл формалина и 20 мл дистиллированной воды. Перемешивают и через 1 мин титруют 0,0099 М раствором гидроокиси калия до рН 8,5, используя блок автоматического титрования ВА1-15. Расход титранта (Ч» ) составляет 5,9 мл. zp Холостой опыт (без фермента) проводят аналогично. Расход титранта (V ) составляет 0,5 мл. Активность аминоацилазы вычислили по формуле (1) ZS (5,90-0,50).0,00В 10,г 10 10. 2,06 МКМ мин мг Пример 2. В термостатированную ячейку к 10 мл 0,5 М N-ацетил-D, 1;метионина, нагретого до 37 С, при перемешивании добавляют 0,2 мл раствора аминоацилазы (содержание белка 3,20 мг) в 0.,1 М фосфатном буфере (рН 7,2) и выдерживают в течение 10 мин. Автоматической пипеткой отбирают 1 мл реакционной смеси и помещают в стакан для титрования (V = 50 мл), содержащий 10 мл формалина и 20 мл дистиллированной воды, перемешивают и через минуту титруют 0,0099 М раствором . гидроокиси калия до 4р рН 8,5. Расход титранта (V» ) составляет 9,25 мл. Холостой опыт (субстрат без фермента) проводят аналогично. Расход титранта (Ч ) 0,72 мл. По формуле (1) вычисляют активность 4> аминоацилазы (9,25 — 0,72) 0,0099.10,2 10з, 10 3,2 ыкМ мин 1 мг Пример 3. В термостатированную ячейку к 10 мл 1 М N-ацетил-D,L-метионина, нагретого до 37 С, при перемешивании добавляют 0,2 мл раствора ацилазы (содержание белка 4,25 мг) в 0,1 М фосфатном буфере (рН 7,2) и выдерживают в течение 10 мин. Автоматической пипеткой отбирают 1 мл реакциб анной смеси и помещают в стакан для титрования (V = 50 мл), содержащий 20 мл формалина и 20 мл дистиллированной воды. Перемешивают и- через минуту титруют 0,0099 М раствором гидроокиси калия до рН 8,7 Расход титранта (Ч„) составляет 12,15 мл. Холостой опыт (без фермента) проводят аналогично. Расход титранта (Va) составляет 0,90 мл, Активность ацилазы вычисляют по формуле (1) (12 15 0 90).0 0099.10 2,10 10 425 =26 7 мг Пример 4. В термостатированную ячейку к 10 мл 1 М N-ацетил-Р,L-метионина, нагретого до 37 С, добавляют 1 г ацилазы, иммобилизованной на силохроме, и выдерживают при перемешивании в течение 10 мин. Автоматической пипеткой. отбирают 1 мл реакционной смеси и помещают в стакан для титрования (Ч = 50 мл), содержащий 20 мл формалина и 20 мл дистиллированной воды. Перемешивают и через 1 мин титруют 0,0099 М раствором гидрооксикалия до рН 8,5. Расход титранта (V„) составляет 7,9 мл. Холостой опыт (без иммобилизованной ацилазы) проводят аналогично. Расход титранта (V,) составляет 0,9 мл. Активность иммобилизованной ацилазы вычисляют по формуле (1) (7,90 — 0,90).0,0099 10 10 10. 1 мкМ мин мг Пример 5. В термостатированную ячейку к 10 мл 0,5 М N-ацетил-D,1=ìåòèîíèíà, нагретого до 37 С, при перемешивании добавляют 0,2 мл раствора аминоацилазы (содержание 2,5 мл) в 0,1 М фосфатном буфере (рН 7,2) и выдерживают в течение 10 мин. Автоматической пипеткой отбирают 1 мл реакционной смеси и помещают в стакан для титрования (Ч = 50 мл), содержащий 10 мл формалина и 20 мл дистиллированной воды, перемешивают и через минуту титруют 0,0099 М раствором гидроокиси калия до рН 8,5. Расход титранта (Vx) составляет 7,8 мл. Холостой опыт (субстрат без фермента) проводят аналогично. Расход титранта (Чо) 0,72 мл. Активность аминоацилазы (7,8-0,72) 0,0099 10,2 10 10 2,5 28 6 мкЯ мин 1 мг Технико-экономический эффект изобретения заключается в сокращении времени анализа в 4 раза и упрощении предлагаемого способа. 968070 Формула изобетения Составитель О. Скородумова Техред И. Верес r Корректор A. Гриценко Тираж 505 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж вЂ” 35, Раушская иаб., д. 4/5 Филиал ППП «Патент», г. Ужгород, ул. Проектная, 4 Редактор Г. Волкова Заказ 7259/40 Предлагаемый способ, позволяет контролировать степень гидролиза N-ацетил-D,L-аминокислот в случаях, когда известными способами нельзя провести анализ без многократного разведения (50 — 100 раз). Способ определения активности аминоацнлазы, включающий инкубацию фермента с субстратом-N-ацетил-D, 1-метионином, прекращение ферментативной реакции и определение количества выделившейся 1-аминокислоты, отличающийся тем, что, с целью упрощения и ускорения процесса и расширения области применения способа, инкубацию осуществляют при содержании субстрата в 8 смеси (5 — 25) 10 М/мг белка, ферментативную реакцию прекращают добавлением в реакционную смесь 5 — 20-кратного избытка формалина, а количество выделившейся L-аминокислоты определяют потенциометрическим титрованием до значения рН 8,5 ++. 0,01. Источники информации, принятые во.внимание при экспертизе 1. М. А. Mitz, R.J. Schlueter, Direct spectrophotomrtric measurement of the peptide 10 bond: Application to the determination of acylase 1, Biochim. Biophys. Acta, 1958, vol. 27, 168 — 172. 2. М. Weetail, С. Detar «Studies of Amino-асу1азе Immobilized on Porous Ceramic Carriers», Biotechnol. and Bioeng., 1974, vol. 16, 1537,.
