Способ определения активности протеолитических ферментов

 

ОП ИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Советских

Социалистических

Республик »>977490 (61) Дополнительное к авт. свид-ву— (22) Заявлено 07.01.80 (21) 2866643/28-13 с присоединением заявки №вЂ” (23) Приоритет— (51) М. К .

С 12 N 9/52

Гооударствеииый комитет

Опубликовано 30.11.82. Бюллетень № 44

Дата опубликования описания 05.12.82 (53) УДК 663.15 (088.8) по делам изооретеиий и открытий (72) Автор изобретения

Л. И. Позднякова

Научно-исследовательский институт механики и...физики при Саратовском ордена Трудового Красного Знамейи" *---= ъосударственном университете им. Н. Г. Чернышевского (7I) Заявитель (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ

ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ

Изобретение относится к микробиологии, а более конкретно к способам исследования ферментов.

Известны способы определения активности протеолитических ферментов, основа нных на гидролизе субстрата с образованием продуктов ферментативной деятельности и последующим выявлением этих продуктов.

Например, для определения ферментативной активности в диализный мешок помещают биологически активную жидкость и исследуемый продукт, содержащий буфер и химический субстрат. В результате реакции получается диализируемый продукт распада субстрата. Мешок погружают в раствор, при этом продукты ферментативной деятельности диффундируют через мешок в раствор, в котором определяют активность данного фермента (IJ.

Известен способ качественного определения активности протеолитических ферменния активности протеалитических ферментов

Сущность способа заключается в следующем: рентгеновская пленка фиксируется тиосульфатом натрия и после промывания

2 тщательно высушивается, испытуемый раствор наносится на пленку, помещается во влажную камеру, инкубируется. Затем пленка промывается, высушивается и красится амидочерным 10 Б. После этого пленка промывается 1%-ной уксусной кислотой (2).

Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности и достигаемому эффекту является способ определения активности протеологических ферментов, предусматривающий приготовление на чашках

Петри агаровых пластинок с добавлением белкового субстрата, нанесение пластинки ферментного раствора с последующей инкубацией и проявлением.

Процесс определения активности проводится в следующей последовательности: на застывший агар наливается раствор казеина, который оставляется на полтора часа для диффузии последнего в агар. Специальной полой трубкой в агаре делаются лунки, которые заполняются испытуемым ферментго ным раствором. Инкубация проводится в термостате во влажной камере в течение

18 — 20 ч. Для облегчения чтения результатов белок в агаре фиксируется трихлоруксусной кислотой. При этом фон становит977490 ся молочно-белым, а вокруг лунки образуется ореол просветления (3).

Недостатком метода являются его трудоемкость, продолжительность, необходимость проведения подготовительных операций: диффузии субстрата в агар и изготовления лунок.

Цель изобретения — упрощение и ускорение процесса определения протеолитической активности.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу определения активности протеолитических ферментов, предусматривающему приготовление на чашках Петри агаровых пластинок с добавлением белкового субстрата, нанесение на пластинки ферментного раствора с последующей инкубацией и проявлением, раствор субстрата непосредственно вносят в расплавленный агар, размешивают, разливают в чашки Петри, на застывший агар накладывают диски фильтровальной бумаги, на которые наносят исследуемый раствор фермента, а инкубацию проводят в термостате в течение 9 в 11 ч.

Технология способа состоит в следующем.

Приготавливают раствор субстрата, вносят, его в расплавленный и остывший до

60 С агар, устанавливают рН исследуемой протеиназы (для кислой протеиназы 3,5, для нейтральной 7). Приготовленную смесь разливают в чашки Петри по 10 мл и оставляют диски фильтровальной бумаги диаметром 10 мм. На диски наносится исследуемый ферментный раствор по 0,1 мл. Для предохранения фермента от подсыхания на крышку чашки Петри накладывают фильтровальную бумагу, смоченную дистиллированной водой. Чашки инкубируются в термостате при 37 С 9 — 11 ч. По истечении указанного времени диски фильтровальной бумаги удаляют с агара, а агаровые пластинки проявляют 1ОО/р-ным раствором трихлоруксусной кислоты или 5О/о-ным раствором соляной кислоты. При этом поверхность агара приобетает молочно-белый цвет, на месте удаленных дисков при наличии активного протеолиза обнаруживаются хорошо выраженные прозрачные зоны.

Пример 1. Определяют активность нейтральной протеиназы, выделенной из Erwinia

carotovora f. citrullis штамп № 603 на казеине. Для приготовления 100 мл субстрата с казеином в 80 мл дистиллированной воды растворяют 1 г агара «Дифко», а

20 мл воды используют для приготовления раствора казеина. 1 г казеина фирмы «Реанал» заливают 4 мл воды и оставляют для набухания. Затем казеин ставят на водяную баню при 60 С, по каплям добавляют

2 М раствора едкого натра (6 капель), затем наибольшими порциями приливают осПример 4. Определяют активность трипсина на желатине. Для приготовления субстрата растворяют в 20 мл бидистиллированной воды на водяной бане при 60 С и смешивают с остывшим до 60 С агаром.

Далее проводят операции по описываемому способу. Время анализа 10 — 11 ч. Отмечен активный протеолиз.

Таким образом, реализация изобретения позволяет упростить и ускорить процесс определения активности протеолитических ферментов. зо

Формула изобретения

Способ определения активности протеолитических ферментов, предусматривающий приготовление на чашках Петри агаровых пласти нок с добавлением белкового суб45 страта, нанесении на пластинки ферментного раствора с последующей инкубацией и проявлением, отличающийся тем, что, с целью упрощения и ускорения процесса, раствор субстрата непосредственно вносят

5О в расплавленный агар, размешивают, разливают в чашки Петри, на застывший агар накладывают диски фильтровальной бумаги, на которые наносят исследуемый раствор фермента, а инкубацию проводят в термостате в течение 9 в ll ч.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Патент США № 3243147, кл. С 12 D опублик. 1968. тавшуюся воду и выдерживают в бане до полного растворения казеина. Готовый раствор казеина смешивают с остывшим до

60 С агаром. Устанавливают рН = 7. Далее проводят операции по описанной выше технологии. Время, затраченное на анализ, равняется 11 ч. Активность нейтральной протеиназы обнаруживается по хорошо выраженным зонам.

Пример 2. Определяют активность кислой

1о протеиназы, выделенной из Erwinia carotovora f. citrullis штамм № 603, на альбумине. Для приготовления субстрата бычий альбумин растворяют в дистиллированной воде при комнатной температуре и смешивают с остывшим до 60 С агаром (в растt5 воре должно содержаться lо/o альбумина и 2/р агара «Дифко»). Устанавливают рН среды = 3,5 и проводят операции по описанной выше методике. Об активности протеолитического фермента судят по хорошо

2О выраженным прозрачным зонам на месте удаленных дисков фильтровальной бумагой.

Пример 3. Определяют активность пепсина на гемоглобине. Субстрат с гемоглобином приготавливают аналогично альбумину.

Через !0 ч инкубации обнаруживают актив25 ныи протеолиз.

977490

Составитель Е. Воробьева

Редактор А. Фролова Техред И. Верес Корректор О. Билак

Заказ 91! 7/32 Тираж 505 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж вЂ” 35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП «Патент», г. Ужгород, ул. Проектная, 4

2. Рябушко Т. А., Вечер, А. С. Прикладная биохимия и микробиология. Т. I, 1965, в. 6, с. 645 — 652.

3. Смирнова М. Н., Акимова В. В., Бурштейн В. А. «Лабораторное дело», 972, № IO, с. 61l — 612 (прототип).