Способ получения корпускулярного антигена

 

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОРПУСКУ; ЛЯРНОГО АНТИГЕНА из поликсеническоЙ культуры дизентерийной амебы путем их выращивания на питательной среде, содержащей сопутствующую бактериальную флору, с последующей очисткой и инактивацией амеб, отличающийся тем, что/ с целью повышения выхода целевого продукта ,за 7-14 час .до посева амеб в питательную среду вносят 0,01-0,04 мл надосадочной жидкости 48-72-часовых культур дизентерийной амебы, содержгидей сопутствующую бактериальную флору, и после вырапщвания проводят очистку амебной взвеси центрифугированием в 8%-ном растворе сахарозы при 1700- § 1800 об/мин в течение 30-35 с. (Л

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

М

РЕСПУБЛИК

Па И»

5(59 A 61 К 39 002

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ABTOPCHOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТОЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЬПЪФ (21) 13 (22) 05.81 (46) 07.04.83. Бюл. У 13 (72) Т.В. Продеус, М.М. Соловьев и Л,М. Гордеева (71) Ордена Трудового Красного Знамени институт медицинской паразитологии и тропической медицины им. Е.И.Марциновского (53) 576.8.097(088.8) (56) 1. М. Goldman "Evaluation of а fluorescent antibody test for

am biasis using two widely diftering

ameba strains as autigen, Amer, Trop. Мед. Hyg.. 1966, М 15, р.694700.

2. Соловьев М.М., Пшеничный Г.С.

Изучение сывороток от больных амебиазом кишечника реакцией флюоресцирующих антител. "Медицинская паразитоло-. гия", 1971, 9 6, с. 64 3-647.(прототип). (54) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОРПУСКУ

ЛЯРНОГО АНТИГЕНА из поликсенической культуры дизентерийной амебы путем их выращивания на питательной среде, содержащей сопутствующую бактериальную флору, с последующей очисткой и инактивацией амеб, о т л и ч а ю— шийся тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта,ва .7-14 час до посева амеб в питательную среду вносят 0,01-0,04 мл надосадочной жидкости 48-72-часовых культур дизентерийной амебы, содержащей сопутствующую бактериальную флору, 5 и после выращивания проводят очистку амебной взвеси центрифугированием в

8Ъ-ном растворе сахарозы при 1700- Я

1800 об/мин в течение 30-35 с.

1009471

Изобретение относится к.области медицины, преимущественно к разделу получения реагентов и препаратов для диагностики паразитарных болезней человека, в частносТи амебиаза.

Известен сцособ получения корпускулярного антигена из поликсенической культуры дизентерийной амебы, заклю, чающийся в выращивании амеб и очистке их от неспецифических компонентов среды (1J . 1О

Известен способ получения корпус" кулярного антигена иэ поликсенической культуры дизентерийной амебы путем ее выращивания на питательной среде, содержащей сопутствующую бактериаль- 15 ную флору, с последующей очисткой и инактивацией амеб )2J .

Однако известные способы приготовления антигена не обеспечивают высокого выхода целевого продукта.

Целью изобретения является повышение выхода целевого продукта.

Цель достигается тем, что в способе получения корпускулярного антиФ гена из поликсенической культуры дизентерийной амебы, предусматриваю-, щем выращивание их на питательной среде, содержащей сопутствующую бак териальную флору; с последующей очисткой и инактивацией амеб, за 7

14 ч до посева амеб в питательную среду вносят 0,01-0,04 мл надосадочной жидкости 48-72-часовых культур ди:=,ентерийной амебы, содержащей сопутствующую бактериальную флору, и после выращивания амеб проводят очистку амебной взвеси центрифугированием в 8%-ном растворе сахарозы при

1700-1800 об/мин в течение 30-35 с °

Способ иллюстрируется следующими примерами. 40

Пример 1. Наращивание амеб в бактериальных пробирках.

В стерильныее пробирки, заполненные на 2/3 средой Павловой (10-12 мл) беэ крахмала, добавляют 0,01-0,04 мл 45 надосадочной жидкости из 48.-72-часовых культур дизентерийной амебы.Пробирки, закрытые стерильными пробками, помещают в термостат (36,6 ОС), Через 7-14 ч на прекондиционированную среду производят посев амеб из 4872-часовых культур. Пробирки инкубируют в горизонтальном положении при

36,6вС. Через 24-28 ч амеб снимают со стенок пробирки и осаждают центрифугированием при 1500 об/мин в течение 5 мин. При посеве 50;100 тыс ° амеб на пробирку с прекондиционированной средой через сутки наблюдается увеличение численности амеб примерно в

5 раз. 60

Пример 2. Наращивание амеб во флаконах для культуры тканей емкостью 100 мл.

Стерильный флакон заполняют на

2/3 средой Павловой (80 мл) без крах-65 мала, вносят 0,07-0,3 мп надосадочйой жидкости иэ культуры дизентерийной амебы. Флакон, закрытый резиновой пробкой, помещают в термостат (36 6оС

Через 7-14 ч вносят взвесь амеб из 2-3 пробирок с 48-96-часовой культурой, из которых предварительно удален крахмал и большая часть среды. Флакон в горизонтальном положении помещают в термастат (36,6 С).

Через сутки (24-28 ч) рост амеб можно оценить визуально по всей горизонтальной поверхности флакона при малом увеличении микроскопа. После осторожного удаления более половины культуральной жидкости амеб снимают со стенок. флакона с помощью стеклянного шпателя или многократным пипетированием культуральной жидкостй, или легким покачиванием. Затем взвесь амеб центрифугируют 5 мин при

1500 об/мин. При посеве 60-150 тыс. амеб наблюдается увеличение численности амеб в 8-12 раз.

Пример 3. Освобождение полученной взвеси амеб от неспецифических компонентов среды.

Взвесь амеб из культуры в объеме

1-1,5 мл осторожно наслаивают на.

5-6 мл сахароэы. Это приводит к самопроизвольному осаждению наиболее крупных частиц и зерен крахмала на дно пробирки. Амебы остаются в верхней части содержимого пробирки. Более деликатная и тщательная очистка от микробного компонента среды достигается центрифугированием. Для этого

2-3 мл верхней части содержимого пробирки наслаивают на столб сахарозы высотой 5 см и центрифугируют в течение 30 с при 1700-1800 об/мий.

Микробные частицы, бактериальные пленки оседают на внутренней поверхности пробирки, поэтому осторожно, не касаясь стенок, содержимое с помощью пастеровской пипетки переносят в другую пробирку. Амеб концентрируют при 1500 об/мин в течение

3-5. мин.

Фиксацию амеб проводят эабуференным 10%-ным формалином и отмывают полученную взвесь. Отмытый осадок суспендируют в забуференном физиологическом растворе (0,015 М и фосфатный буфер — 7,2) из расчета получения в капле взвеси от 20 до 40 амеб при малом увеличении микроскопа. Взвесь амеб переносят на размеченные предметные стекла с кружками диаметром до 8 мм. После естественного высыхания (2-3 ч)i фиксированная на предметных.стеклах взвесь интактных, отмытых в сахарозе, свободно лежащих амеб служит антигеном для постановки реакции.

Предлагаемый .способ позволяет повысить выход амеб (через 24 ч куль1009471

Составитель П. Бонарцев

Техред А.Вабинец Корректор A. Ференц

Редактор О. Юркова

Заказ 2539/4 Тираж 711 Подписное

ВНИИПИ Государствениого комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 тивирования количество амеб в 1 мл среды 250000-300000, тогда как в известном способе через 48 ч культивирования количество амеб 50000-70000).

КрОме того, предлагаемый способ по сравнению с известным позволяет снизить необходимость в приготовлении антигена до 9-10 раэ в год, так как антиген можно готовить через 6-7 недель, вместо 2-3 недель по известному.