Способ количественного определения коэнзима а в лейкоцитах

 

„„Я0„„1040412, СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ЭИ), 01 М 3 4

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЭО6РЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ; " :..::,::. --.

Ъ

* i

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

/ (21 ) 2662824/28-13 . - . проведения реакции ацетилирования (22) 04.09.78 с использованием и -аминобензойной (46) 07.09.83. Бюл.РЗЗ :кислоты с последующим внесением ре (72) A.Ã. Мойсеенок, М.А» Рыбалко,. -- -:. .агента.. для определения продуктов

;Е.A. Цвербаум и В.Н. Петров - ацетилирования, по количеству кото 171 ) Отдел регуляции обмена веществ. - .,рых определяют количественное содерAH БелорУсской CCP и Иркутский го . мание коэнзима:А, о т л и ч а ю сударственный медицинский институт,; шийся тем, что, с целью повиае (53) 615.361.014.41(088.8) ния точности способа лейкоциты пред(56) 1. М.М. Алимова, Г.A. Михеева.. .,;.. варительно до проведения реакции аце"Исследование ацетилирующей способнос тилирования кипятят с водой, с обра ти крови in vitro ж.Лабораторное . ...: зовавшимся экстрактом проводят реакдело, М., Медицина, ВЗ, 1965, . -.:.- цию ацетилирования путем дополнитель:с.159-160. ного внесения ацетонового порошка печени, а в качестве реагента для (54.)(57) СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕ- . определения продукта ацетнлировання

ДЕЛЕНИЯ КОЭНЗИМА A В ЛЕЙКОЦИТАХ путем,. . используют .п -диметилбензальдегид.,I

1, 1040412

Изобретение относится к биологии 1 М раствора ацетата натрия, 2 мл и медицине и может быть использовано 0,2 И раствора цитрата натрия 0,1 мл при экспериментальных и клинических Я 1 М раствора солянокислого цистеина исследованиях для определения коэнзи- и 0,1 мл 1М свежеприготовленного растма А. вора бикарбоната натрня и 0,25-0,5 мл

Известен способ количественного 5 10%-ного раствора ацетонового порошопределения коэнзима A (KQA) в тканях ка печени в 0,02 N растворе бикарбо(лейкоцитах ) путем проведения реакции ната натрия. ацетилирования с. использованием Содержимое пробирки тщательно пере -аминобензойной кислоты (IIASK) с пос- мешивается и инкубируется 1 ч при и-ами ледующим внесением реагента для QIIpe- 37 С. Реакция останавливается доба—

Во о вделения продуктов ацвтилирования, лением 1 мл 15% раствора трихлоруксуспо количеству которых определяют ко- ной кислоты, пробы центрифугируются личественное содержание кознзима (.1 3. 15 мин при 3000 об/мин.

Однако известный способ не являет- К 0,5 мл центрифугата добавляют ся достаточно точным вследствие не- t5 1 мл воды и 0,5 мл 5 н. Раствора солядостаточной интенсивности реакции .ной кислоты. Вносят 2 мл свежеприцетилирования нативными лейкоцитами готовленного 2% спиртового раствора и развития у них дополнительной окрас- п-диметиламинобензальдегида. Проб

ы ки для определения продуктов ацетили- через 15 мин колориметрируются при рования. 453:нм кювета 5 мм. Количество сво20

Цель изобретения — повышение точ- бодной IIASK в исследуемых пробах ности способа количественного опреде- определяется по калибровочной кривой. ения (,KoA) в лейкоцитах. В качестве контроля используются л

Поставленная цель достигается тем, . пробы, в которых трихлоруксус ая ная т согласно способу количественного 25 кислота вносится перед инкубацией. ссчитыопределения КоА в лейкоцитах, ключаю- В каждой отдельной пробе рассчи щему проведение реакции ацетилирования, вается количество ацетилированной с использованием tl-аминобензойной ПАБК (разница между контролем и кислоты с последующим внесением реа- опытом ) в мкг на. 1 млн. лейкоцитов гента для определения продуктов ацети- за 1 ч инкубации. При наличии образлирования, по количеству которых- ца КоА ацетилирующая активность определяют количественное содержание выражается в нг КоА на 1 млн лейкоКоА предварительно до проведения цитов. реакции ацетилирования лейкоциты ки- Пример., Для определения возпятят с водой, с образовавшимся экст можности использования способа как рактом проводят реакцию ацетилирова З5 критерия оценки обеспеченности органия путем дополнительного внесения низма человека пантотеновой кислотой ацетонового порошка. печени, а в обследовали 4 группы лиц: 1-я — здорокачестве реагента для определения вые доноры, получающие обычное сбапродукта ацетилирования используют лансированное питание, 2-я — здоров«диметилбензальдегид. 40 вые доноры, получающие, обычное питаСпособ осуществляют следующим ние и однократную энтеральную нагрузку 200 мг пантотената кальция, .3-яК 5 мл венозной кРови добавляют здоровые доноры, получающие обычное

1 каплю раствора гепарина (1 ХЕ() питание и однократную парентеральную и 1 25 мл 6%-ного РаствоРа сРедне- 45 нагрузку 200 г пантотената кальция, .I

Н молекУлЯРного полиглюкина, остоРож о 4-я — больн хрон еским алкоголиз перемешивают и помещают в стакан, мом, характеризу ихся втор ной со льдом а 1-1,5 ч. Плазма со вэве-, (эндогенной ) недостаточностью пантошенными в ней лейкоцитами отсасываетпипеййой и осле подсчета коли чества форм о енных элементов центриу метода избраны соответствие изменений фугируется à ол д р и ется на холоде при 3000 об/мин е мин. К осадку лейкоцитов Уро вня КоА в лейкоцитах характеру ают мл д обеспеченности организма паитотеновой приливают мл д ают 1 мл дистиллированной кислотой и соответствие изменений асти ают стеклянной палочкой ипятят на водяной бане 7-8 мин. 55 показателя суммарному содержанию и кипятят на дя микробиологически определяемых форм пантотената в экстракте лейкоцентрифугируется, и в количестве

0,25-0,5 мл используется для аналиВ стеклянную пробирку помещают 60 В таблице приводятся результаты

0,25-0 5 мл прозрачного лейколизата, исследования.

У

0,2-0,5 мп инкубационной смеси, 0,3 мл ацетилирующей смеси, содержа- Представленные данные подтверждают адекватность реакции уровня КоА

1,6 мл 0,05 М раствора

° АТФ 0 5 мл g5 в лейкоцитах состоянию обеспеченности

1040412

Предлагаемый способ определенйя-. ! кознзима А прост, надежен,позволяет определить содержание КоА в лейкоцитах с высокой точностью и в короткий срок. организма пантотеновой кислотой и прямо коррелируют с содержанием микробиологически определяемых форм витамина в лейкоцитах.

Обследуемая группа

Количество наблюдений

Количеств о ацетилированной IIAIiK ,на 1 млн.лей ;коцитов,нг

73, 2+3,7

166,5+6,9

153,9 7

28,3+1,5 Составитель Л. Морозова

Редактор Л. Пчелинская Рехред Т.Фанта Корректор О. Тигор

Заказ 6921/48 Уираж 873.. . . Подписное

ВНИИПИ Государственного. комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, й-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул.- Проектная, 4

12 ч0

Количество

- KoA на

1 мпн,лейкоцитов нг

-66,1+3,3

150,3+6,2

139,2+6,4

25,5 1,5

Количество общей пантотеновой кислоты на 1 млн. лейкоцитов, нг

89,4 4,9

179,6+7,7

168,8+7,8

34,6 -1,35