Способ получения вещества 41 200 @ ,обладающего иммуностимулирующим действием

 

Способ получения вещества, обладающего иммуностимулирующим действием , заключающийся, в том, что водную суспензию клеток Micrococcus sedogenes штамма И 78 (NRRo6B-3505) обрабатывают лизоцимом из расчета 2-20 мг/г сухих клеток при рН 6,5 8,0 в течение 1-3 ч и температуре С,из полученной жидкой фазы выделяют целевой продукт в виде соли , обрабатывают его.водным раствором хлористого кальция при конечной концентрации его в растворе 5-50 г/л, затем отделяют целевой продукт, растворяют его в виде до концентрации 10-50 г/л, добавляют равный объем фенола и выделяют целевой продукт с молекулярной массой 510-510 методом фракционирования на молекуСО лярном сите.

COIO3 СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

„„SU„„4 2 A

3(511 А 61 К 39/00 // С 12 Р 1/04 (С 12 Р 1/04 ° С 12 К 1/265)

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

fl0 ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ

" - 5 с

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ = .: .,:3

И ПАТЕНТУ (21) 2909299/28-13 (22) 17.04.80 (31) 7909743 (32) 18.04.79 (33) Франция

1 (46) 15.09;83. Бюл. N 34 (72) Иан Флоран, Жан Люнель, Дениз

Манси и Бернар Вюйемэн (франция) (71) Рон-Пуленк Эндюстри (Франция) (53) 576.097.2(088.8) (56) 1. Заявка Франции N 2189020, кл. А 61 К 23/00. // С 12 К 5/00, опублик. 1974. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВЕЩЕСТВА 41 200 R P ОБЛАДАЮЩЕГО ИММУНОСТИМУЛИРУЮЩИМ ДЕЙСТВИЕМ, (57) Способ получения вещества, о6ладающего иммуностимулирующим действием, заключающийся. в том, что водную суспензию клеток Micrococcus

sedogenes штамма M 78 (NRRc6B"3505) обрабатывают лизоцимом из расчета

2-20 мг/г сухих клеток при рН 6,58,0 в течение 1-3 ч и температуре

20-42 С,из полученной жидкой фазы о выделяют целевой продукт в виде соли, обрабатывают его водным раствором хлористого кальция при конечной концентрации его 8 растворе 5-50 г/л, затем отделяют целевой продукт, растворяют его в воде до концентрации 10-50 г/л, добавляют равный объ- ем фенола и выделяют целевой продукт с молекулярной массой 5 10 -5 10 6 методом фракционирования на молекулярном сите.

1042602

Изобретение относится к микробиологии и иммунологии, и касается способа получения вещества, обладающего иммуностимулирующим действием.

Известен способ получения водораст- 5 воримого вещества микробактериальной природы, обладающего иммуностимулирующей активностью (1) .

Однако известный способ обеспечивает получение иммуностимулятора из микробактерий.

Целью. изобретения является получение вещества 41 200 R P, обладающего иммуностимулирующим действием.

Цель достигается тем, что соглас" но способу получения вещества, обладающего иммуностимулирующим действием, водную суспенэию клеток Mic"

rococcus sedogenes штамма М- 78 (NRRg

В-3505) обрабатывают лизоцимом из рас-20 чета 2-20 мг/г сухих клеток при рН 6,5-8,0 в течение 1-3 ч и температуре 20-42оС из полученной жидкой фазы выделяют целевой продукт в виде соли, обрабатывают его вод- 25 ным раствором хлористого кальция при конечной концентрации его в растворе 5-50 г/л, затем отделяют целевой продукт, растворяют его в воде до концентрации 10-50 г/л, добавляют щ равный сфьем фенола и выделяют целевой продукт с молекулярной массой

5 105-5 10 методом фракционирования. на молекулярном сите ° Используемый для осуществления

35 способа продуцент Micrococcus sedogenes штамм М 78 выделен иэ образца почвы, взятой в Бразилии. Штамм депонирован в Лаборатории северных региональных исследований в США.

Депортамент сельского хозяйства под номером МККК В-3505.

Штамм M 75 Мicrococcus sedogenes характеризуется следующими свойствами.

Культурально-морфологические признаки.

При выращивании в статических условиях в течение 24 ч при 26 С обо разует кокковидные граммположитель" ные клетки не резистентные к кисло50 там, иммобильные, диаметром 1-1,3 микрона, отдельные или сгруппированные по 2 или 4 клетки, или в виде цепочек иэ 4-16 клеток, или в виде беспорядочных скоплений по 20-50 кле- 55 ток, Наличие спор не наблюдалось.

На скошенном питательном агар" агаре образует жирный обильный налет, ровный или слабо, бугорчатый, без запаха, не окрашенный, мягкой консистенции.

На питательном агар-агаре в чашках Оетри образует круглые колонии с ровными краями и гладкой поверхностью, колонии сплющены или слегка выпуклые, непрозрачные.

В питательном глюкоэусодержащем бульоне дает помутнение среды, без запаха, без пигмента, образует хлопьевидный осадок.

На картофеле образует жирный налет, гладкий, бледно-желтого цвета, без почернения картофеля; растворимый пигмент не образует. физиолого-биохимические свойства.

Строгий аэроб. Оптимальная температура роста: 4оС - не развивается, 22 С - хорошее развитие, 26 Сочень хорошее развитие (opt), 30 С хорошее, развитие, 37оС - посредственное развитие, 45 C - не развивается. Нитраты в нитриты восстанавливает. Хромогенез отрицательный.

Индол и сероводород не образует.

Желатин не разжижает в течение 21 дня.

Казеин гидролизует. Тест на метилрот отрицательный. Реакция Voges

Proskauer отрицательная.

Молоко не коагулирует, не пептонизирует; подщелачивание до рН 6,17,5 между первым и двадцать первым днем.

Реакция на каталазу положительная, реакция на оксидазу отрицательная.

Не сбраживает до кислоты глюкозу, галактозу, арабинозу, сахарозу, лактозу, маннитол, глицерол.

Крахмал гидролизует. Эскулиновая среда - без почернения.

На среде с 44 NaC1 развитие среднее, с 104 йаС 1 - не развивается.

Мочевину в качестве единственного источника азота не усваивает.

Уреаэа - отрицаТельно.

Хитин не гидролизует.

На автотрофной среде с (NH4) 504 в качестве единственного источника азота.не развивается, нитриты иэ

МН не образует, Ф

В качестве источника углерода усваивает крахмал, зтанол, ацетат натрия, пропионат натрия, янтарную кислоту, яблочную кислоту, цитрат натрия, пируват. натрия. Слабо усваивает или совсем не усваивает ри10426 бозу, арабинозу„ глюкозу, лактозу,. мальтозу, сахарозу, инозитол„ трегалозу, глицерол, манитол, глутаровую кислоту, тертрат натрия, галактуроновую кислоту. 5

Используя цитрат натрия в качестве источника углерода и заменяя

МНАН PO ° основной среды различными

4 2 4 азотсодержащими соединениями, установ- лено, что штамм хорошо усваивает 10

NaNO, NaN0, КН Н РО4, 0 -аспарагин, сукц нимид, глицин, 0Ы;аланин, Оф;

-аснарагиновую кислоту, Dat.-/+/ -глутаминовую кислоту, -/-/-тирозин, Ось-пролин. Не усваивает аденин, ура- 15 цил, креатинин, О-/+/-глюкозамин, саркозин,а - /+/-аргинин, Ы-метионин, бетаин.

Способ получения вещества 41 200

R P.îñóùåñòâëÿåòcÿ следующим образом. 20

Культивирование может быть осуществлено всеми методами аэробного

; культивирования - поверхностным или глубинным.

Ферментационная среда может со- 25 держать в качестве источника углерода декстрин, крахмал, спирты, молочную лимонную кислоты, и другие углеродсодержащие вещества. Можно использовать некоторые растительные или животные масла, такыре как свиное сало или соевое масло.

В качестве источника азота можно использовать неорганические или органические соли аммония, некото35 рые аминокислоты. Они могут быть внесены с различными комплексными веществами, такими как казеин, лактальбумин, глутен и их гидролизаты, соевая мука, арахисовая мука, рыбная мука, экстракты из мяса, дрожжей, растворимые остатки от дистилляции зернового спирта, жидкость после замачивания кукурузы.

Сера и фосфор обычно вносятся в достаточном количестве с различными вышеперечисленными комплексными веществами. Они могут также быть, . внесены в виде сульфатов и фосфатов., Из минеральных соединений можно

50 использовать фосфаты щелочных или щелочно-земельных металлов или карбонаты кальция или магния, хлориды и сульфаты щелочных или щелочно-земельных металлов или соли цинка, кобальта, железа, меди; марганца, 55 рН исходной ферментационной среды

6,0-7,8, .предпочтительно 6,5-7,5.

Оптимальная температура ферментации .

02 4

25-30 С, но удовлетворительное производство достигается при 20-35 С.

Аэрация ферментации может изменяться в довольно широких пределах. Аэра. ция 0,3-3 л воздуха на 1 л среды в минуту наиболее оптимальна. Максимальный выход получают через 8-20 ч, культивирования, предпочтительно через 15 ч, причем время ферментации зависит главным образом от используемой среды. рН - ферментационной среды в конце культивирования обычно составляет 7,3-8,8, предпочтительно 8,0-8,4.

Биомассу отделяют от ферментационной среды путем фильтрации или центрифугирования, предварительно подкисляя культуральную жидкость, до рН 3,0 с помощью соляной кислоты.

В дальнейшем можно испольэовать либо неочищенные бактериальные клетки, либо осуществить дегидратацию лиофилизацией или промывку спиртом или ацетоном, затем высушить при пониженном давлении, получая очищенные высушенные клетки. Перед их последующим использованием предпочтительно полученную биомассу прогревают при 120-130 С в течение 3060 мин.

Пример 1, В ферментер емкостью 170 л загружают пептон

1200 r мясной экстракт 600 r, сое=

Ф

5 вое масло 1200 см, водопроводную воду до 110 л. Устанавливают рН 6,9 добавлением 10 н. раствора йаОН, затем среду стерилизуют путем барботажа пара при 122 С в течение 40 мин. Далее б среду охлаждают для конденсации па. ра, получая объем среды 120 л,. рН среды 6,7. Засевают 200 см культуры Niciococcus sedogenes штамм M 78. о

Культивирование проводят при 27 С в. течение 14 ч при перемешивании и аэрации стерильным воздухом. Получают посевной материал. ферментацию проводят в ферментере емкостью 800 л в питательной среде, содержащей, кг; 1 -молочная кислота 4; соевое масло 2; сульфат аммония 2,4, хлористый натрий 2; первичный фосфат калия 0,4, сульфат магния 7Н20 0,8; сульфат меди 5Н О

0,02", сульфат цинка 7Н О 0,012; хло; ристый кобальт 6Н О 0,008. Кроме того, питательная среда содержит до с

370 л водопроводной воды . рН среды доводят до 7,1, добавляя 2950 см 3

10 н. раствора едкого натра. Затем нием на лабораторней центрифуге

Sharpies со скоростью 40000 об/мин с дебитом 5 л/ч. Верхний слой диализуют на целлюлозной мембране. в течео ние трех. дней, при 4 C по отношению к 3 ° 40 л деминерализованной воды.

Удержанное вещество затем обрабатывают в колбе с помощью 310 см полистиролсульфоновой смолы DOW8 Х

50 ° 2 в натриевом цикле, перемешивая в течение 1 ч; смолу отфильтровывают и промывают на фильтре 310 см воды.

Промывные воды объединяют с фильтратом и лиофилиэируют. Получают 17 г

32919, и Р в .солевой форме, характеристики которой следующие: внешний вид: порошок белого цвета; состав: 15,7i воды (по Фишеру), на сухой вес,3: протеин (сумма аминокислот) 24,6; полисахариды 3,93, нуклеиновые кислоты 28,9 (по спектру УФ).

Элементный состав,3: С 46,30;

Н,5,84; О (по разности) 30,71; N

10,04; P 3,11; S ниже 0,5; Na 3,70;

Са 0,30.

25 г полученного вещества

32919 R P растворяют в 1 л деминерализованной воды, содержащейся в реакторе емкостью 2 л, снабженном мешалкой и устройством для регулирования температуры; добавляют

1 л смеси фенола с водой (109 см

3 воды на 1 кг фенола), Смесь нагревают до 65 С при интенсивном перемешивании. Перемешивание продолжают в течение 30 мин при этой температуре. После быстрого охлаждения реактора с помощью ледяной бани до температуры, близкой к 25 .С, разделяют фазы центрифугированием при 3300 g в течение 30 мин на лабораторной центрифуге с охлаждением (JOUAN тип К 63 Fl емкостью 4 л. Получают 450 см З водной фазы. фенольную фазу и промежуточную фа-. зу снова экстрагируют 1 л деминералиэованной воды в течение 30 мин при

65 C После охлаждения и центрифугирования, как указано выше, снова получают 1470 см водной Фазы. Водные фазы объединяют. Фенол.удаляют двумя последовательными промывками с помощью 2 л хлороформа каждый раэ. Водные фазы затем осветляют центрифугированием в течение 30 мин при 3300 .

Получают 1800 см водной фазы.

Осветленную водную фазу диалиэуют в течение трех дней при 4 С по «т.!

S 1042602 среду стерилизуют барботированием пара при 122 С в течение 40 мин, После охлаждения объем бульона составляет

400 л, рН 4,2 доводят до 6,6 добавлением 2100 см водного 5 н. раст- 5 вора НаОН, Среду засевают 40 л посевного материала. Ферментацию ведут при

27 С в течение 16 ч при перемешивании со скоростью 205 об//мин и при

1О . аэрации стерильным воздухом со скоростью 15 м /ч.

По окончании процесса ферментации рН 8,2 объем культуральной жидкости

440 л.

Культуральную жидкость охлаждают до 4 С, рН доводят до 3,0 добавлением 4 л 5 н. соляной кислоты.

Биомассу отделяют центрифугированием при 2900ф . Клетки извлекают 20

80 л этанола с температурой (-10 С) при перемешивании в течение 15 мин затем центрифугируют и высушивают при 35 С при пониженном давлении (5 мм рт.ст,) в течение 15 ч, Полу25 чают 1500 r сухих клеток.

1 кг сухих клеток суспендируют в 40 л стерильной дистиллированной воды в реакторе из нержавеющей стали, снабженном двойной рубашкой. Ус- 30 танавливают рН 7,0 10 н. растаэром едкого натра. Затем добавляют 2 r лизоцима и перемешивают в течение

2 ч при 37 С, периодически доводя

D рН до 7,0 5 н, раствором едкого .нат- З5 ра.

Смесь центрифугируют на машине

Sharpies М 16/2 со скоростью

17000 об/мин с дебитом 30 л/ч. Верхний слой (37 л ) ультрафильтруют (an- 40 парат UFP 20, снабженный акриловой мембраной 1815 3042), рециркулируя задержанную часть и добавляя

3 раза по 40 л деминерализованной

40 воды, охлажденнои до 4 С.

Собирают 7 л удержанного вещества, концентрированного с мол. вес. выше 25000 дальтон рН доводят до

7,0 5 н. раствором NaOH и лиофилизируют. Получают 147 г сырого продук

° та. 31 r сырого, продукта растворяют в 1550 см деминерализированной о воды при температуре около 20 С, перемешивая в течение 30 мин, затем добавляют в течение 5 мин при постоянном перемешивании 31 см водного раствора 668 г/л: СаСl> 2Н О и перемешивают в течение 30 мин. Образовавшийся осадок удаляют центрифугирова7 1042 ношению к 3 40 л деминерализованной воды. Удержанное вещество лиофилизи. руют. Получают 14, 5 г аморфного порошка белого цвета.

8 г этого порошка растворяют в 00 см 0,1 M стерильного буфера иэ ацетата натрия с рН 7 (растворяют

136,09 г ацетата натрия для анализа в 0,9 л деминерализованной воды, затем доводят рН до 7,0 добавлением .10 уксусной кислоты, d l 049)и доливают до 1 л. Стерилизацию осуществля-. ют нагреванием в течение 45 мин при .

122 С . Этот раствор разбавляют до

1/10 стерильной деминералиэованной, 15 водой ех tempore.

Полученный раствор выливают в колонку с sepharose С1 4В " (диаметр

13,5 см, высота 65 см), помещенную в холодную камеру (40С), забуференную. 20

0,1 М стерильным буферным раствором ацетата натрия, рН 7,0. Элюирование осуществляют с помощью того же самого буфера с дебитом 1,33 л/ч, реги. стрируя непрерывно абсорбцию при 25

230 нм при 0,1 см элюата.

Собирают сначала фракцию 3,13.л,, которую удаляют. Следующую фракцию (1,22 л), которая соответствует пику абсорбции при 230 нм, вводят в . трубку е регенерированной целлюлозой

N0JAX(1 и диализуют при 4 С в теО чение трех дней по отношению к 3

° 40 л деминерализованной воды, затем удержанное вещество (1300 см ) лио3 филизируют. Полученное твердое вещество обрабатывают 93 см деминерализованной воды и раствор деалиэуют с по мощью указанной мембраны в течение

48 ч при 4 С по отношению к 2 ° 20 л. деминерализованной воды. Удержанную часть лиофилиэируют.

Получают 1,3 г вещества 41 200 RP характеристики которого следующие: внешний вид: аморфный порошок бело- 4 го цвета.

Основные полосы ИК-абсорбции se" щества 41200 R Р, выраженные в волновых числах, см (о.с. - очень сильная с - сильная; cp. - средняя; е ь °

5 сл. — слабая; о.сл. - очень слабая. пл. - плечо):

3420 о.с. (в которой Н20)

3280 пл.

3090 пл.

2970 пл.

2950 пл.

2920 с.

2845 ср.

602 8

2680 пл.

2100 o ° сл. 1230 ср. 775 сл.

1730 пл. 1210 пл. 720 пл.

1645 о.с. 1160 с. 630 пл.

1545 с. 1115 с. 560 с. (в которой Н О)

1460 пл. 1060о.сл.520 пл.

1440 пл. 1025 пл. 480 пл.

1405 пл. 945 ср. 450 пл.

1375 с. 900 сл. 400 пл.

1335 пл. . 875 сл. 365 пл.

1310 ср. 800 ср.

Состав: 3,.83 (по Фишеру);на сухой вес, 4: аминокислоты 12,3 (иэ которых

74 аланина); глюкоза 11,95; нуклеиновые кислоты менее 1,3 (по УФ-спектру); аминосахар 16;3.

Элементный анализ,Ф: С 45,58;

7 47; N 4 85; 0 37; Р 1, 17; Cl Oь,25)

Na 2,36; Са 1,33; S менее 0,5; электрофорез., В геле с 1ь агароэы с барбиталовым буфером с рН 8,6 и при напряжении

6 Ч/см 41200 R P мигрирует к аноду со скоростью примерно 11 мм/ч.(Продукт обнаруживается с помощью реактива

Шиффа после периодического окислеНия и с помощью soudan черного В).

Пример 2. Посевной материал получают согласно примеру 1. После культивирования в течение 16 ч сусло охлаждают до 4 С и его рН устанаво ливают равным 3 путем добавления соляной кислоты. Клетки выделяют центрифугированием со скоростью . 4000 об/мин. Клеточный кислый слой затем нагревают в автоклаве в тече" ние 45 мин при 122 С. После охлаждео ния клетки промывают этанолом, затем высушивают.

Оперируя как в примере l (ферментация и выделение) и используя тв же количества, получают 0,55 г вещества 41200 R P в форме аморфного порошка белого цвета, характеристики которого следующие: состав: 64 воды (по Фишеру); на сухой вес: аминокислоты 17,7 (из которых 7,2ã. аланина); глюкоза 10,5, нуклеиновые кислоты менее 3, аминосахар 15,2.

Элементный анализ, 4: С 46,90;

Н732; N5938; О 35; Р1,08;С1018;

Na 2,26; Са 1,83; S менее 0,5.

ИК-спектр этого продукта идентичен с веществом 41200 R P, полученным в примере 1.

При введении мышам внутривенно, подкожно,,интраперитонеально или инт1ранаэольно вещество 41200 R P значи042602

Составитель Смирнова

Редактор M.Äûëûí Техред M.Tenep Корректор О.Билак

Заказ 7151/59 Тираж 713 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4

9 1 .тельно повышает сопротивляемость мы- .шей, зараженных летальной дозой 1 1steria monocytogenes Staphylococcus

aureus Escherichia coli и вирусами, такими как энцефаломиокардитный вирус, вирус мышиного гепатита, вирус гриппа (человеческий вирус, адаптированный на мыши, типа Ао и А ), вирус герпеса и арбовирус. Повышенное резистентное состояние длится в течение 96 ч после обработки.

Введенный парентерально мышам этот продукт сильно стимулирует фагоцитарную способность ретикулоэндотелиальной системы и повышает (в экспери,менте на крысах) количество лимфоцитов, продуцирующих антитела. Испытывают стимулирующий эффект в реакции гиперчувствитвльности замедленного типа и по продуцированию антител по отношению к отдельным антигенам.

У мыши, которой пересажены клетки (например, клетки саркомы 180),введение полученного вещества вызывает некротическую реакцию. В некоторых условиях вещество, полученное по данному способу, повышает количество и/или цитолитическую активность лимфоцитов Т крысы па отношению к опухолевым аллогенным клеткам.

Использование предложенного способа позволяет получить вещество

41200 R Р, обладающее иммуностимули рующим действием.