Способ получения оксипроизводных индолил-3-уксусной кислоты

 

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ОКСИПРОИЗВОДНЫХ ИНДОЛИЛ-3-УКСУСНОЙ кислоты путем гидроксилирования ИНД опил-3-уксусной кислоты с помощью мицелия культуры Asperg-ieBus ИБФМ-Р-212, отличающийся тем, что, с целью интенсификации процесса , используют мицелий указанной культуры , иммобилизованный в полиакриламидном геле.

СОКИ СОВЕТСНИХ

СОЦ)4АЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН

ÄÄSUÄÄ 1016360 А

ЗШ С 12 P 17/10; С 12 Р 7/42;

С 12 Р 1/685 С 12 N 11/04 . 1

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТ8ЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 3299006/28 13 (22) 05,06.81 (46.) 07.05.83. Бюл. М 17 (72) Т, Г. Баклашова, К. А. Кощеенко, Е. А. Чепынева и Г. К. Скрябин (71) Институт биохимии и физиологии микроорганизмов АН СССР (53) 577.15(088.8) (56) I. "Biotechn. and Bioeng", 1970, ХП, 1, р. 19.

2. Кощеенко К. А. и цр. О гицроксилировании индолил-3-уксусной кислоты грибов АЬрегфЮиь nip er ИБФМ =Г-12."Прикладная биохимия и микробиология", .

1972, ХШ, вып. 2, с. 248-253. (54)(57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ОКСИПРОИЗВОДНЫХ ИНДОЛИЛ- -УКСУСНОИ КИСЛОТЫ путем гицроксилирования инцолил-3-уксусной кислоты с помощью мицелия культуры А spe (p И us ю g Е г

ИБФМ-F-212, отличающийся тем, что, с целью интенсификации процесса, используют мицелий указанной культуры, иммобилизованный в полиакрил амицном геле.

1016360

Изобретение относится к мецицинской и химико-фармацевтической промышлен ности и касается микробиоаогического способа гидроксилирования индольного соединения индолил-3-уксусной кисло5 ты (ИУК).

Ферменты, осуществляющие такой про цесс гидроксилаэы можно отнести к группе малоизученных ферментов, для функционирования которьм необходимы различные кофакторы. В то же время известно, что иммобилиэованные клетки можно рассматривать как полиферментиую систему, способную r. регенерации «офак торов и, вследствие этого, имеющую

15 высокую стабильность. Кроме того, в ря/ де случаев иммобилизованные клетки имеют более высокую ферментативную актив» ность как по сравнению со свободными клетками, так и но сравнению с иммобили

0 эованными ферментами.

Известен способ гидроксилирования ве шества 5 Рихштейна в Пф-положении иммобилизованной в полиакрипамидном геле культурой Согу08аг а оиаМ. Вре25 мя трансформации 15 ч, иммобилизован ная культура используется однократно (в периодическом процессе), после чего на блюдается снижение активности $1) .

Наиболее близким к изобретению по технической сушности является способ получения оксипроиэводных индолил-3уксусной кислоты путем гидроксилирования индопил-3-уксусной кислоты (ИУК) с помощью мицелия культуры А рЮ"gi88us З5 мц"ег ИБФМ- -.212, При этом количество. во 5-ОН-ИУК составляет 60%, 4-ОНИУК 40%.

При осуществлении этого способа куль туру для трансформации обычно вырашив - 40 ют на синтетической среде в течение 1824 ч до серецины логарифмической фазы роста, затем мицелий многократно отмы-. вают стерильной водопроводно водой и используют для проведения процесса 45 гид роксилирования с исходной концентрацией ИУК 0,5 г/л $2) .

Недостаток этого способа - однократность использования мицелия, т.е. для проведения каждой трансформации необ- . 5О ходимо заново выращивать купьтуру, процесс невозможно вести в непрерывном режиме, Кроме того, недостаточно высок съем продукта с единицы биомассы культуры (соответствеино 0,3 и 0,2 мг/мг биомассы).

Целью изобретения является интенси икация процесса гидроксилирования индолил3-уксусной кислоты, под которой подразумевают обеспечение возможности многократного испопьзования культуры, увеличение времени работы культуры при сохранении высокой гидроксилируюшей активности, повышение выхода продукта на единицу мицелия, обеспечение возможности перевода процесса в непрерывный режим.

Указанная цель достигается тем, что согласно способу получения оксипроизводных индопил-3-уксусной кислоты путем гидроксилирования индолил-3-уксусной

«ислоты с помощью мицелия культуры AsрегфИо и4 е - ИБФМ-(-212, исполь зуют мицелий указанной культуры, иммобилиэованный в полиакриламидном геле.

С цепью стабилизации гидроксилаэной активности мицелия в процессе использования, его инкубируют в питательной среде, содержащей источники углероца, азота и минеральные сопи, затем проводят трансформаци1о на гопоцной среце, в воде или буферном растворе.

Пример . КультуруА ergiE6us

hig8 ИБФМ-Р-212 выращивают на синтетической среце следующего состава, гlл: (ЙН4.)Д.НРО4 2,0; НРО4 1,0; MgSO4.

7 НРО 0,5; KCg 0,5; 8904. 7 Н 0 0,01;

СОСО> 3,0; глюкоза 20,0; белково-вита минный концентрат 3,0; вода дистиллиро» ванная до 1,0 л.

Через 18-24 ч роста мицелий отмывают от среды тройным обьемом стерильной водопроводной BORbL Отмытый мицелий используют для полимеризации: берут 1,5 г влажного мицелия (вес сухого, мицелия 300 мг) в 6 мл фосфатного буферного раствора (рН 5,5), прибавля ют 11 мл раствора мономеров (1,9 r акриламида и О,1 г метиленбисакриламида в 11 мл воды), 4 капли Й,Й,N, N

-тетраметилэтиленднамина, разведенного водой (1:1) и 3 мл 0,5%-ного раствора персульфата аммония. Попимеризацию проводят при 5-8 С. Образовавшийся гель протирают через сито с размером пер 1000-2000 мкм, Полученные гранулы отмывают декантацией стерильйой водопроводной водой (8-10 раз) и дважды по 600 мл фосфатным буферным раствором (рН 5,5). Отмытые гранул суспен« дируют в 100 мл фосфатного буферного раствора, помешают в две конические колбы Эрленмейера обьемом 250 мл с 50 мл буферного раствора в каждой.

В копбы вносят по 1 мл этанольного раствора ИУК, содержашего 25 мл ИУК.

Трансформацию проводят при 28 С на ка360

3 1016 чалке 220 об/мин. Гидроксилирование полностью проходит за 24WO ч с образованием 55-60% 5-ОН-ИУК и 45-40%

420Н-ИУК.

Контроль за ходом трансформации S осуществляют методом качественной и количественной тонкослойной хроматографии на пластинках S 8ufoR О д . На хроматографическую пластинку наносят полосой культуральную жидность (из расчета 20 мкг вещества), разделение продуктов трансформации проводят в системе изопропанол - бенэол- концент рированная MNq (4:1:1 об/об). Хроматограммы просматривают в УФ-свете на ультрахемископе.

Для количественного определения продуктов трансформадии используют спектрофотометрический метод. Оптическую плотность элюированных этанолом 20 продуктов определяют при) дх 278 ммк (5-ОН-ИУК) и 269 ммк (4-0Н-ИУК).

Количество МУК и ее оксипроизводных определяют по заранее построенным калибровочным кривым. 25

Пример 2 . Выращивание культуры и иммобилизадию мипелия проводят по примеру 1. Далее отмытые гранулы суспендируют в 100 мл стерильного Б

: сусла в медицинской колбе объемом 750 мл и помещают на качалку 220 об/мин . при 28 С. Через 20-24 ч инкубации в о питательной среде гранулы многократно отмывают сначала стерильной водопровод- ной водой, а после этого стерильным фосфажым буферным раствором (рН 5,5).

Затем проводят трансформацию по примеру 1. Гидроксилирование полностью проходит эа 15-18 ч с образованием 40-45% 4-ОН-ИУК и 55-60% 5-ОНИУК. При увеличении концентрации ИУК до 1 мгlмл гидроксилирование проходит эа 24 ч.. После проведения трансформации гранулы, отделенные от реакцион45 ной среды, промывают 5 раэ по 200 мл стерильной водопроводной водой, 2 раза по 100 мл, буферным раствором (pH 5,5) и используют для следующей трансформапии. Гранулы с иммобилиэованным ми целием используют многократно. При снижении гидроксилируюшей актииносги проводят повторное инкубироиание гранул и питательной среде и затем новую серию последовательных трансформадий. Эту операцию повторяют до необратимого сни- жения гидроксилируюшей активности.

Возможно 18-24-разовое использование гранул с мицелием при трехразовой периодической инкубации их в питательной среде.

Пример 3 . Выращивание культуры, . иммобилизацию и инкубироиание гранул в питательной среде проводят по примерам 1 и 2. Гранулы после инкубации отмывают и помешают в стеклянную термостатироианную колонку (высота колонки 110 мм, диаметр -30 мм) с воз- . душным барботером, высота столба гранул 50,0 мм. Снизу в колонку с помощью перистальтического насоса подается раствор 1/15 M фосфатного буфера р Н 5,5, содержащий 0,5 мг/мл ИУК. При удель;I

\ t мг гранул- ч

0,1 ч " и 28 С колонка работает в течение 15 дн беэ снижения активности, суммарное количество оксипроиэводных и течение этого периода 60-70%.

В таблипе представлены результаты сравнения гидроксилирующей активности свободного и иммобилизованного в ПААГ мицелия

Иэ таблицы видно, что при использовании свободного мицелия биомасса используется однократно, удельная активность составляет 1,25; при использовании иммобилиэованного в ПААГ мицелия сокращается время трансформации и увеличивается удельная активность. Инкубация гранул с мицелием в питательной среде . позволяет значительно увеличить время работы используемого для трансформации мицелия. В зависимости от условий опыта биомасса участвует в периодической трансформации многократно, либо в непрерывных условиях. Удельная активность инкубированных гранул с иммобилизованным мицелием выше активности свободного мицелия в 1,6 раз.

Количество образованного оксипроиэводного на единицу биомассы у свободного мицелия составляет 0,3 мг/1 мг биомассы. При использовании иммобилизованных гранул, инкубированных в питательной среде, количество оксипроиэводного на единицу биомассы возрастает в зависимости от условий опыта в 8 или 24 раза и составляет соответственно 2,4 либо 7,2 Mr/1 мг биомассы.

Таким образом, предлагаемый способ дает возможность получать оксипроиэводные не только в периодических, но и в непрерывном процессе.

Переход от периодического процесса производства к непрерывному с использованием иммобилизованных клеток поэСвободный ми целнй

1,25

02 . . 24

0,3

Иммобилизованный мицелий

1,50

ЦЗ, 0,2

2,00

0,2

0,3

Инкубированный в- питательной среде

2,00

120

1,6

2,4

2,00

360

4,8

7,2

7,2

2,00

360

Колонка

Непрерывно

4,8

Составитель О. Скородумова

Редактор И. Николайчук Техред К.Мыдьо . Корректор М. Шароши

Заказ 3321/27 Тираж 523 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113034, Ж-35, Москва, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4

S . - 1016360 d в<мнет в большей степени автоматиэи- ций беэ снижения гидроксилируюшей актй.ровать процесс. ности, значительно увеличивается выход

Иммобилизации культуры A9 g< us оксипроиэводных ИУК на единицу биомас ид в " ИБФМ- г 212 в полиакриламид сы мицелия. Возможно 18-24-разовое ный гель.дозволяет испольэовать иммо 5 использование гранул с мицелием, а такбилизованный мицелий для проведения же проведение непрерывного процесса многократных. периодических трансформа гидроксилирования ИУК в колонках.