Циклический аналог энкефалина, обладающий пролонгированной анальгетической активностью

 

Циклический аналог энкефалина формулы NHj- СН-СО-Туг -DMet- (ly -Phe -Рго И CHrCHrCHf-CHrNH- обладающий пролонгированной анальгетической активностью. г 1 00 О ю

СООЗ СОВЕТСКИХ.

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

02 А. (1Е (11) (5D 4 С 07 K 7/12, 7/64, А 61 К 37/02

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ABTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Ю вМ

Известны природные метионин- и лейцин — энкефалины (НТут-Gly-GlyPhe-Net-0H- и HTyr-Gly-Gly-Phe-Leu0Н соответственно), проявляющие морфиноподобную активность в опытах на специфических моделях опиатного påГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 3347297/23-04 (22) 16.10.81 (46) 30.08.89. Бюл. У 32 (71) Институт органического синтеза

АН Латвийской CCP (72) Г.И. Чипенс,.И.В. Боброва, Н.А. Абиссова и В.Е. Клуша (53) 547.964.4.07(088.8) (56) Hughes J.; Smith Т.W., Ковйег-. :.litz Н.W.,Fotergill L.À.,Norgan В.А., Norris -R.H."Identification of two related pentapeptides from the brain

with p6tent opiate agonist activity", Nature, 1975, 2Ц, с. 577.

Вйеscher Н.H., Hill R.S., Roemer D.

Cardinaux F., Closse А., Hauser D

Pless J. "Evidence for analgesic ac.tivity of enkephalin in the maise", Nature, 1976, 2Я, с. 423.

Hudson D, Sharpe R., Szelke М.

"Nethionine encephalin and isosteric

analogues",Int. J.Pept. Protein Res., 1980, l с.122..

Heda Н., Amano Н., Shiomi И., Takagi Н. "Comparison of the analgesic effects of — various opioid

peptides by à newly devised intra,cisternal injection есЬп1Чие in

consious mice", Eur. J. Pharmacol, 1976, 56, с. 265.

Изобретение относится к новому биологически активному соединению— циклическому аналогу, энкефалина, обладающему пролонгированной анальге-, тической активностью, которое может найти применение в медицине.

2 (54) ЦИКЛИЧКСКИЙ АНАЛОГ ЭНККфАЛИНА, ОБЛАДАЮЩИЙ ПРОЛОНГИРОВАННОЙ АНАЛЬГЕТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ . (57) Циклический аналог энкефалина формулы

NH CH-C0 — Tgr — DMet- Qlg -Phe-Pro г

СН СН СНр СН МН обладающий пролонгированной анальгетической активностью.

3 10487 цептора, а также подавляющие стереоспецифическое связывание с рецептоРом опиатного антагониста налоксона в гомогенатах мозга.

Однако метионин- и лейцин- энкефалины обладают слабой и кратковременной(5-15 мин) анальгезией при внутрижелудковом введении в мозг мыши.

Известны близкие структурные аналоги описываемых соединений - циклические аналоги энкефалина, включающие в цикл 18 атомных группировок формул.

СН CO Туг 91ц — 61 Fhe Met

3 Ч

NH

Однако эти соединения показывают полное отсутствие специфической ак- 20 тивности энкефалина.

Цель изобретения — расширение арсенала средств воздействия на живой организм.

Поставленная цель достигается описываемым циклическим аналогом энкефалнна формулы

ИН- СН-СО=Туг-РИе1- ф1у

СН -СН - СН - СН - НН

30 обладающим пролонгированной анальгетической активностью.

35 энкефалин (I) синтезирован известными методами пептидной химии в растворе согласно приведенной схеме с использованием активированных эфиров трет-бутилоксикарбониламинокис- 40 лот, Я -аминофункцию лизина защищают бензилоксикарбонильной группой, гидроксил тирозина — бензильным радикалом.

На чертеже приведена схема синте- 45 за.

Пример. Для синтеза аналога энкефалина (I) используют аминокислоты и их производные фирмы "Reanal" (Венгрия). Все аминокислоты, кроме

D-Метионина, имеют L-конфигурацию.

Температуру плавления веществ определяли, в капилляре (без коррекции) .Индивидуальность промежуточных соединений контролировали с помощью

ТСХ на пластинках "Silufol" (ЧССР) в следующих системах растворителей: хлороформ — этанол-- уксусная кислота (АсОН), 85:IO:5 (А) н-бутанол-пири02 4 дин-АсОН-Н О, 15:10:3:6 (B), н-.áyтанол-АсОН-Н О, 4:1:1 (С).

Аналоги энкефалина хроматографируют на пластинках фирмы "Merck" в системах:хлороформ-метанол - АсОН- Я О, 30:20:4:6 (D), 60:18:2:3 (Е), н-бутанол-пиридин-АсОН-Н О, 15:12:3:10 () °

Удельное оптическое вращение пептидов измеряют на поляриметре "Perkin—

ЕВmer 141 M" (ФРГ). Кислотный гидролиз проводят при 120 С в течение

24 ч. Аминокислотный- состав определяют на анализаторе "Jeol-3". Для всех соединений данные элементного анализа удовлетворительно совпадают с вычисленным содержанием С, Н, N.

По данным аминокислотного анализа для гексапептидов получен удовлетворительный аминокислотный состав.

N"òðåò -бутилоксикарбонил-глицил-L-фенилаланин (7).

6,60 r (40 ммоль) L-фенипаланина растворяют в 40 мл 1 н. раствора гидроокиси натрия, добавляют 3;44 r бикарбоната натрия, 50 мл диметилформамида (ДМФА) и 16,94 г (40ммоль) пентахлорфенилового эфира трет-бутилоксикарбонил-глицина, растворенного в 20 мл .ДИФА. Смесь перемешивают в течение нескольких часов. После завершения реакции (хроматографический контроль) реакционнун массу разбавляют этилацетатом и водой (до разделения слоев), охлажцают до 0 С и подкисляют 0,5 н. соляной кислотой до рН 3. Этилацетатный слой отделяют, водную фазу экстрагируют повторно. Объединенный зтилацетатный слой промывают водой, насыщенным раствором хлористого натрия и сушат над.. безводным сульфатом натрия. Кристал-. лический остаток, полученный после отгонки растворителя, перекристаллизовывают из этилацетата с небольшой добавкой петролейного эфира.

Выход дипептида (7) 11.,4 r. (88X), й.пл. 133-I35 С, /Ы/ + 15,7 (с 1, ДЕФА), Rf 0,73 (А); Rf 0,80 (D).

N-третбутилоксикарбонил-глицил-L ôåHèëàëàíèë-пролин (9).

3,22 г (10 ммоль) дипептида (7) растворяют в 10 мл этилацетата, охлаждают до 0 С и при перемешнвании добавляют 2,02 r (11 ммоль) пентафторфенола и 2,26 г (ll ммоль) дициклогексилкарбодиимида (ДСС), растворен0,78 r (2,6 ммоль) N áåíçèëîêñèкарбонил-L-лизина растворяют в 5,2 мл

0,5 н. гидроокиси натрия, добавляют

0,22 г (2,6 ммоль) бикарбоната натрия, 10 мл ДМФА и активированный эфир пентапептида (14) в ДИФА. Через

48 ч реакционную массу расслаивают между этилацетатом и 5Х-ным раствором бисульфата калия. Этилацета ный слой

5 . 10487 ных в этилацетате. Через 2 ч смесь охлаждают до -10 С, выпавшую дициклогексилмочевину отфильтровывают, растворитель отгоняют, маслообразный остаток растирают с гексаном до затвердения. Получают 4,4 r пентафторфенилового эфира дипептида (8), Rfp 0,85 (А) .

1,03 г (9 ммоль) L-пролина раство- 10 ряют в 16 мл ДМФА и при перемешивании добавляют ) 26 мл (9 ммоль) триэтиламин в 2 мл ДМФА и 4,4 г (9 ммоль) пентафторфенилового эфира дипептида (8), растворенного в 4 мл ДМФА. Реак- 15 ционную массу перемешивают несколько о часов, ДМФА отгоняют при 40 С, остаток растворяют в этилацетате и- обрабатывают аналогично соединению (7) .

Продукт, полученный после отгонки 20 растворителя, хроматографируют на колонке с силикагелем в системе: хлороформ — гексан — EtOH 10:4:1. Соответствующие фракции объединяют, раст-, воритель отгоняют, сушат в вакууме. 25

Выход 3,3 г (87%) трипептида(9);

/Ы/ — 31,1 (с I,ÄMÔÀ); Rf 0,77 (С) .

N-трет-бутилоксикарбонил-О-бензип- .

-L-тирозил-D-метионин (10).

К 2,09 r (14 ммоль) D-метионина 30 прибавляют 28 мл 0,5 н. раствора гидроокиси натрия, перемешивают, затем .прибавляют 1,18,(14 ммоль) бикарбоната натрия, 20 мл ДМФА и 6,89 г. (14 ммоль) нитрофенилового эфира 35

N-трет-бутилоксикарбонил-О-бензил--Ь-тирозина, растворенного в 30 мл

ДИФА. После .завершения реакции (около -48 ч) реакционную массу обрабатывают и выделяют продукт (10) ана- 40 логично соединению (7). После перекристаллизации из смеси этилацетата. и гексана получают 4,8 г (68%) дипептида (10), т.пл. 129-132 С,, /е /д> - 2,0 (с 1, ДИФА) Rf 0,72 (А), 4

N-трет-бутилоксикарбонил-О-бензилL-тирозил-D-метионил-глицил-L-фенилаланил-L-.ïðîëèí (13)

3,52 r (7 ммоль) дипептида (10) растворяют в 20 мл этилацетата с- небольшой добавкой ДИФА, охлаждают до

О С и при перемешивании добавляют

1 41 г.(7,7 ммоль) пентафторфенола и 1,58 г (7,7 ммоль) ДСС, растворенных в этилацетате. После окончания .реакции дициклогексилмочевину отфильтровывают, растворитель отгоняют, кристаллический остаток растирают с гексаном. Получают 4,1 г пентафтор02 б фенилового эфира дипептида (ll);

Rf 0,94 (А).

2,34 г (5,6 ммоль) трипептида (9) растворяют в 15 мл. 70Х-ного раствора трифторуксусной кислоты (TFA) в дихлорметане и выдерживают 30 мин.

Растворитель отгоняют, остаток растирают с эфиром, отфильтровывают, промывают эфиром на фильтре и сушат в вакууме над гидроокисью калия. По- . лучают 2,3 г (94%) трифторацетата (12);Rf 0,67 (О)

2,3 r (5,3 ммоль) трифторацетата (12) растворяют в 15 мл ДИФА и при о перемешивании и охлаждении до 0 С добавляют 1,1 мл (10,6 ммоль) N-метилморфолина в 2 мл ДИФА и 3,5 r (5,3 ммоль) пентафторфенилового эфира дипейтида (11), растворенного в

10 мл ДМФА. Реакционную массу перемешивают несколько часов и после завершения реакции обрабатывают аналогично соединению (7). Продукт, по- лученный после отгонки растворителя, очищают на колонке с силикагелем.

Элюирование проводят в системе. хлороформ — этанол — этилацетат — AcOHН О 285:5:8:2:0,25. Соответствующие фракции собирают, упаривают и сушат в вакууме.

Выход 2,1 г (49%) пентапептида (13); /oC/ — 10,4 (с l, ДМФА) Rf

О, 5 i (А); Rf О, 72 (Р, "Merck") ..

N-трет-бутилоксикарбонил-0-бензил-L-тирозил-D-метилнил-1лицил-LЯ а

-фенилаланил-L-пролил-N --(N- бензилоксикарбонил)-L-лизин (15).

2,09 г (2,6 ммоль) защищенного пентапептида (13) растворяют в 20 мл

ДМФА, охлаждают до О С и при перемешивании добавляют 0,53 r (2,9 ммоль) пентдфторфенола, 0,59 r (2,9 ммоль)

ДСС, растворенных в ДМФА. По- завершении реакции дициклогексилмочевину, отфильтровывают, растворитель отго-. няют, остаток растирают с гексаном.

Получают активированный эфир пентапептида (14); КЕ 0,67 (А).

1048702 отделяют, водную фазу экстрагируют повторно. Объединенный этилацетат промывают водой, насыщенным раствором NaCl, сушат над безводным сульфатом натрия. Продукт, полученный после отгонки этилацетата, хроматографируют аналогично соединению (13).

Выход: 1,54 r (57%) гексапептида (15), /о(/д, — 14,1 (с 1, ДМФА);

Rf О 69 (В)

Цикло /Ф(Я -бензилоксикарбонил)-L-лизил=О-бензил-L-тирозил-D-метионил-глицил-Ь-фенилалнил-L-пролил/ (17) .

0,5 r (0,5 ммоль) гексапептида (15) растворяют в 2 мл 70%-ного раствора TEA в дихлорметане и выдерживают в течение 30 мин. Растворитель отгоняют, остаток растирают с эфиром и сушат в вакууме. Получают 0,51 г (94%) трифторацетата гексапептида (16), Rf 0,5 (Е, "Nerck"); Rf 0,1 (А) .

0,4 (0,37 ммоль) трифторацетата гексапептида (16) растворяют в

400 мл очищенного ДМФА, охлаждают до

-20 С, прибавляют триэтиламин до рН

7,2 и медленно прибавляют 0,11 мл (0,5 ммоль) дифенилфосфорилазида в

50 мл ДМФА. Раствор перемешивают в течение 7 дней, периодически добавляют триэтиламин, поддерживая рН около 7. По окончании циклизации растворитель отгоняют при 40 С, к осо татку прибавляют 1-2 мл этилацетата.

Нерастворившийся осадок отфильтровывают и хроматографируют на колонке с силикагелем в системе хлороформ— метанол — АсОН 85:10:5.

Выход: 145 мг (40%) циклогексапептида (17); /Ы/, +15,2 (с 0,5, AcOH); Rf 0,60 А, "Merck").

Цикло-(N -Ь-лиэил-,С-тирозил-D45

-метионил-глицил-1-фенилаланил-L-пролил) (I).

К раствору 60 мл (0,063 .ммоль) соединения (16) в 5 мл метанола и

2 мл АсОН добавляют палладиевую чернь, 0,5 мл воды и гидрируют в течение 4 дней. Катализатор отфильтровывают, фильтрат упаривают досуха, остаток растирают с эфиром, отфильтровывают, сушат в вакууме над гндроокисью калия. Полученный продукт

55 очищают на КМ-целлюлозе {СМ-32 фирмы

Whatman") в аммоний-ацетатном буфере(градиентное элюирование). Соответствующие фракции собирают и лиофилизуют.

Выход: 35 мг (76%) циклогексапептида энкефалина (I); /о / +25,7 (с 0,33, 0,2 н. АсОН); Rf 0,52 (Д, "Merck"), Rf 0,48 (В, "Nerck").

Проведены биологические испытания аналога описываемого энкефалина— цикло (N -Lys-DMet -Pro )-энкефалина.

Биологическую активность описываемого аналога энкефалина (1) исследуют в опыгах ж vivo. Анальгетическую активность определяют по методу

Heda Н. В работе были использованы беспородные мыши-самцы массой 20 r.

Исследуемое вещество, растворенное в стерильном физиологическом растворе, вводят при помощи I-образной иглы в cisterna magna мозга неанестезированным мышам в количестве 10 мкг.

Исследовался диапазон доз от 0,1 до 100 мкг/животное. Контрольным животным вводят 10 мкг стерильного физиологического раствора. Каждая экспериментальная группа состоит из

10 мышей. Анальгетический эффект соединения оценивают по тесту "tail pinch" при помощи артериального зажима, накладываемого на основание хвоста. Определение болевой реакции проводят через 5,15,30,60 и 90 мин после введения и затем каждые 30 мин до исчезновения анальгетической реакции.

Результаты выражают альтернативным методом (процент мышей, показавших анальгетическую реакцию). При вычис- . лении ED используют метод Литчфилда и Уилкоксона. Анальгетическая ак тивность и продолжительность действия соединений приведены в таблице.

Цикло-(N -Lys, D Net+, Pro)- энкефалин обладает выраженной анальгетической активностью. Максимальный эффект наблюдается на 5-15 мин после введения. Анальгетическая активность нового аналога (I) значительно превышает активность природных энкефалинов (II и III) и сопоставима по величине и продолжительности действия с анальгетическим эффектом морфина.

Характерной особенностью является значительная пролонгация анальгетического эффекта. Продолжительность аналгезин при ED 8„ составляет 90 мин.

Доза 100 мкг/животное вызывает аналь гетический эффект продолжительностью

2,5 ч (у энкефалинов 15 мин)

104870 2

ЛДб0 ) 100 мкг/животное

Е1 >0 5,1 мкг животное

>20

1О применение в медицине.

Анальгетическая активность энкефалина и его аналога при интрацистеральном введении мьппам

Е.ЭЯ) (Т ) ммоль/животное

Ф соеди нения

Продолжительность аналгезии мин

Момент максиСоединение мального эффекта, мин

5, 9(1,6-23,3)

223(160-310)

146(99-215), 1,9(0,5-5,6) 5-1 5

90

)5 ъ60

1) ED —. эффективная доза исследуемого соединения, которая вызывает анальгетический эффект у 50Х подопытных животных, 2) при ED60 60 у

3) в. работе использовался морфин гидрохлорид в ампулах производства Ташкентского ХФЗ.

Р-ЯВФ бф РЮВ Аю 4Е

Техред M.Моргентал Корректор М. Пожо

Редактор Л. Письман

Тираж 339

Заказ 4975

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35 ° Раушская наб., д. 4/5

Подписное

Производственно-издательский комбинат "Патент", r.yæãîðîä, ул. Гагарина,1 01

Анальгетическая активность описываемого соединения исследована в диапазоне доз от О,! до 100 мкг/жи- . вотное. Эффективная доза (ED 0 ) при этом 5,9 ммоль/животное (или 5,1 мкг/

/животное) °

В интервале изученных доз не было .отмечено случаев гибели животных.

Сделан вывод, что ЛД > 10б мкг/животное, и вычислен терапевтический

Цикло-(N -Lys,D Net

6 о

Рго )-энкефалин

Лейцин-энкефалин

Метионин-энкефалин

Морфин индекс описываемого циклического аналога энкефалина:

Полученные результаты подтверждают, что описываемый циклический аналог энкефалина обладает выраженной анальгетической активностью и может найти