Полинуклеотидная последовательность, кодирующая протокадгерин pc3, pc4, pc5 (варианты), полипептид протокадгерина pc3, pc4, pc5 (варианты)

 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для разработки терапевтических и диагностических средств. Полинуклеотидную последовательность, кодирующую протокадгерин человека, выделяют из библиотеки ДНК головного мозга плода человека и секвенируют. Варианты протакадгерина человека обозначают рс3 и рс4. Полинуклеотидную последовательность, кодирующую протокадгерин крысы, выделяют из библиотеки ДНК крысы, секвенируют и обозначают рс5. Протокадгерины имеют свойства белков межклеточной адгезии. Изобретение позволяет получать протокадгерины рекомбинантным путем. 6 с. и 12 з.п.ф-лы, 3 ил., 2 табл.

Настоящая заявка является частичным продолжением Международной патентной заявки РСТ/US 93/12588, поданной 23 декабря 1993 г., которая, в свою очередь, является частичным продолжением заявки на патент США peг. 07/998003, поданной 29 декабря 1992 г.

В общих чертах, настоящее изобретение относится к материалам и методам, имеющим отношение к межклеточной адгезии. Более конкретно, настоящее изобретение относится к новым адгезивным белкам, называемым протокадгеринами, и к полинуклеотидным последовательностям, кодирующим эти протокадгерины. Настоящее изобретение также относится к способам ингибирования связывания протокадгеринов с их натуральными лигандами/антилигандами.

Предшествующий уровень техники В условиях in vivo межклеточная адгезия играет важную роль в различных процессах широкого ряда, включая морфогенез и органогенез, экстравазию лейкоцитов, метастазирование и инвазию опухолей, а также образование агрегаций клеток. Кроме того, межклеточная адгезия играет ключевую роль в сохранении целостности ткани.

Межклеточная адгезия опосредуется специфическими адгезивными молекулами клеточной поверхности. Молекулы клеточной адгезии подразделяются, по крайней мере, на четыре семейства, включая суперсемейство иммуноглобулинов, суперсемейство интегринов, семейство селектинов и суперсемейство кадгеринов. Все типы клеток, образующих твердые ткани, продуцируют определенные виды молекул семейства кадгеринов, что позволяет предположить, что кадгерины участвуют в избирательной адгезии некоторых типов клеток.

В общих чертах, кадгерины были описаны как гликозилированные интегральные мембранные белки, которые имеют N-концевой внеклеточный домен (N-концевые 113 аминокислот этого домена, очевидно, непосредственно участвуют в связывании), состоящий из пяти субдоменов, отличающихся тем, что они имеют последовательности, уникальные для кадгеринов; гидрофобный трансмембранный домен; и С-концевой цитоплазматический домен, который взаимодействует с клеточным скелетом посредством катенинов и других ассоциированных с цитоскелетом белков. Однако у некоторых кадгеринов цитоплазматический домен отсутствует и, очевидно, механизм действия таких кадгеринов, опосредующих клеточную адгезию, отличается от механизма действия кадгеринов, имеющих цитоплазматический домен. Цитоплазматический домен (у кадгеринов, содержащих этот домен) необходим для осуществления адгезивной функции внеклеточного домена. Связывание между членами семейства кадгеринов, экспрессируемых на различных клетках, является гомофильным (то есть, когда член семейства кадгеринов связывается с кадгеринами своего собственного или близкородственного подкласса), и Са²⁺-зависимым. Обзорное описание кадгеринов приводится в недавно опубликованных работах Takeichi, Аnnu. Rev. Biochem., 59: 237-252 (1990), и Takeichi, Science, 251: 1451-1455 (1991).

Первые из описанных кадгеринов (Е-кадгерин, найденный в эпителиальных мышиных клетках; L-CAM, найденный в печени птиц; увоморулин, найденный в мышиной бластоцисте; и САМ 120/80, найденный в эпителиальных клетках человека) были идентифицированы благодаря их участию в Са²⁺-зависимой клеточной адгезии, их уникальным иммунологическим свойствам и их тканевой локализации. В связи с более поздней иммунологической идентификацией N-кадгерина, тканевое распределение которого, как выяснилось, отличается от тканевого распределения Е-кадгеринов, стало очевидным, что эти кадгерины представляют собой новое семейство молекул, опосредующих Са²⁺-зависимую межклеточную адгезию.

В результате клонирования генов, кодирующих К-кадгерин (см. Nagafuchi et al., Nature, 329: 341-343 (1987)), N-кадгерин (Hatta et al., J. Cell. Biol., 106: 873-881 (1988)) и Р-кадгерин (Nose et al. , EMBO J.,6: 3655-3661 (1987)), были получены структурные данные, свидетельствующие о том, что кадгерины представляют собой семейство молекул, обеспечивающих клеточную адгезию. Клонирование L-CAM (Gallin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 84: 2808-2812 (1987)) и увоморулина ( Ringwald et al., EMВО J., 6: 3647-3653 (1986)) выявило, что эти молекулы идентичны Е-кадгерину. Сравнение аминокислотных последовательностей. E-, N- и Р-кадгеринов показало, что степень аминокислотной идентичности для этих трех подклассов кадгеринов составляет около 45-58%. Liaw и др. (EMBO J., 9:2701-2708 (1990)) описали использование полнмеразно-цепной реакции (PCR) с применением вырожденных олигонуклеотидов на основе консервативных областей, Е-, N- и Р-кадгеринов для амплификации N- и Р-кадгерина из кДНК бычьих эндотелиальных клеток капилляров.

В работе Suzuki и др. ( Gell Regulation, 2: 261-270 (1991)) сообщается о выделении с помощью PCR еще восьми кадгеринов. Затем было описано несколько других кадгеринов, включая R-кадгерин (Inuzuka et al., Neuron, 7: 69-79 (1991)). М-кадгерин (Donalies, Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 88: 8024-8028 (1991)), В-кадгерин (Napolitano, J. Cell. Biol., 113: 893-905 (1991)), и Т-кадгерин (Ranscht, Neuron, 7: 391-402 (1991)).

Кроме того, были описаны белки, имеющие отдаленное родство с кадгеринами, например, такие, как десмоглеин ( Goodwin et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 173: 1224-1230 (1990) и Koch et al., Eur. J. Cell. Biol., 33: 1-12 (1990)), и десмоколлины (Holton et al., J. Cell. Science, 97: 239-246 (1990)). Внеклеточные домены этих молекул структурно родственны внеклеточным доменам типичных кадгеринов, однако, все они имеют уникальный цитоплазматический домен. Mahoney и др. (Cell 67: 853-668 (1991)) описали опухоль-подавляющий генсупрессор дрозофилы (Drosophila), обозначаемый fat, который также кодирует кадгерин-родственный белок. Этот ген-супресоор fat состоит из 34-х кадгерин-подобных субдоменов, за которыми следуют участки четырех EGF -подобных повторов, участок трансмембранного домена, и участок нового цитоплазматического домена. Идентификация указанных кадгерин-родственных белков показала, что существует большое суперсемейство белков, характеризующихся наличием типичной последовательности ("мотива"), соответствующей внеклеточному домену кадгерина.

В результате исследований тканевой экспрессии различных кадгерин-родственных белков было установлено, что каждый подкласс молекулы имеет уникальный тип тканевого распределения. Так, например, Е-кадгерин был обнаружен в эпителиальных клетках, тогда как N-кадгерин был обнаружен в нервных и мышечных клетках. Очевидно также, что экспрессия кадгерин-родственных белков подвергается пространственной и временной регуляции в процессе развития клетки, поскольку отдельные белки, как обнаружилось, экспрессируются конкретными клетками и тканями на определенных стадиях развития (см. обзор Takeichi (1991), см. выше). Эктопическая экспрессия кадгерин-родственных белков, а также ингибирование нативной экспрессии кадгерин-родственных белков затрудняет образование нормальной тканевой структуры (Detrick et al., Neuron 4: 493-506 (1990); Fujimori et al., Development, 110: 97-104 (1990); Kintner Cell., 69: 225-236 (1992)).

Уникальный тип временной и тканевой экспрессии различных кадгеринов и кадгерин-родственных белков имеет особенно важное значение, когда учитывается роль, которую может играть каждый подкласс белков в нормальных in vivo-процессах (например, в поддержании кишечно-эпителиального барьера) и в патологических in vivo-процессах (например, в метастазировании опухолей или в воспалительных процессах). Очевидно, что различные подклассы или комбинации подклассов кадгерин-родственных белков ответственны за различные явления межклеточной адгезии, где могут оказаться желательными терапевтическая диагностика и/или терапевтическое воздействие. Например, аутоантитела от пациентов, страдающих обыкновенной пузырчаткой (pemphigus vulgaris) (аутоиммунного кожного заболевания, характеризующегося образованием внутриэпидермальных пузырей), вызываемой отсутствием клеточной адгезии, реагируют с кадгерин-родственным белком, обеспечивая, тем самым, непосредственную поддержку адгезивным функциям кадгеринов in vivo ( Amagai et al., Gell., 67: 869-877 (1991)). Проведенные исследования позволяют предположить, что кадгерины и кадгерин-родственные белки, помимо адгезивной активности, могут также обладать регуляторными функциями. Matsunaga и др. (Nature. 334: 62-64 (1988) сообщают, что N-кадгерин обладает активностью, стимулирующей отрастание аксонов нервной клетки. Ген-супрессор опухолевого роста fat Drosophila, очевидно, регулирует клеточный рост и подавляет опухолевую инвазию, как это происходит в случае Е-кадгерина млекопитающих (см. Mahoney et al., см. выше; Frixen et al., J. Cell. Biol., 113: 173-185 (1991); Chen et al., J. Cell. Biol., 114: 319-327 (1991); и Vleminckx et al., Cell. 66: 107-119 (1991)). Поэтому в некоторых случаях может оказаться желательным терапевтическое воздействие на регуляторную активность кадгерин-родственных белков, экспрессируемых в специфических тканях.

Таким образом, необходимость в идентификации и характеризации дополнительных кадгерин-родственных белков, участвующих в межклеточной адгезии и/или регуляторных процессах, остается актуальной. Кроме того, в связи с тем, что кадгерин-родственные белки могут быть использованы в качестве основы для разработки терапевтических и диагностических средств, необходимо клонировать гены, кодирующие эти белки. Информация об аминокислотных последовательностях кадгерин-родственных белков и ДНК-последовательностях, кодирующих эти белки, поможет обеспечить крупномасштабное продуцирование этих белков посредством рекомбинантной техники, а также идентификацию тканей/клеток, продуцирующих указанные белки в естественных условиях. Такая информация о последовательностях может также способствовать получению антител или других связывающихся молекул, реагирующих c кадгерин-родственными белками, которые могут быть использованы для модулирования реакций связывания с натуральными лигандами/антилигандами, в которых участвуют данные белки.

Краткое описание изобретения Настоящее изобретение относится к материалам и методам, касающимся кадгерин-родственных белков, участвующих в межклеточной адгезии. В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к очищенным и выделенным полинуклеотидам (например, к смысловой и антисмысловой нитям ДНК и РНК), кодирующим новые молекулы клеточной адгезии, называемые в данной заявке протокадгеринами, включая протокадгерин-42, протокадгерин-43, протокадгерин рс3, протокадгерин рс4 и протокадгерин рс5. Предпочтительными полинуклеотидными последовательностями настоящего изобретения являются геномные и кДНК-последовательности, а также целиком или частично синтезированные ДНК-последовательности, и их биологические копии (то есть копии последовательностей, полученных in vitro ). В настоящей заявке также рассматриваются биологически активные векторы, содержащие полинуклеотидные последовательности.

Конкретно проиллюстрированные полинуклеотидные последовательности протокадгеринов настоящего изобретения представляют собой вставки в плазмидах pRC/ RSV -рс42 и pRC/ RSV-pc43, которые были депонированы Американской коллекцией типовых культур (ATСC) (12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852) 16 декабря 1992 под номерами допуска ATСC 69162 и 69163 соответственно.

Научная ценность данных, полученных в результате раскрытия ДНК- и аминокислотных последовательностей настоящего изобретения совершенно очевидна. Так, например, данные о частичной или полной ДНК-последовательности, кодирующей протокадгерин, дают возможность с помощью ДНК/ДНК-гибридизации или PCR-техники выделить полноразмерные кДНК- или геномные ДНК-последовательности, кодирующие данный белок (или его варианты), а в случае геномных ДНК-последовательностей точно определить протокадгерин-специфические регуляторные последовательности, такие как промоторы, энхансеры и т.п. Альтернативно, ДНК-последовательности настоящего изобретения могут быть химически синтезированы стандартными методами. Методы гибридизации и PCR-техника также позволяют выделить ДНК-последовательности, кодирующие гетерологичные белковые молекулы, гомологичные протокадгеринам, конкретно проиллюстрированным в данной заявке.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения хозяйские клетки, а в частности эукариотические и прокариотические клетки, стабильно трансформируют или трансфецируют полинуклеотидными последовательностями настоящего изобретения таким образом, чтобы эти клетки могли экспрессировать полипептиды протокадгеринов. Хозяйские клетки, экспрессирующие полипептидные продукты протокадгеринов при их культивировании в соответствующей культуральной среде, могут быть использованы, в частности, для крупномасштабного продуцирования полипептидов протокадгеринов, их фрагментов и вариантов, что дает возможность легко выделить нужные полипептидные продукты из клеток или из среды, в которой эти клетки были культивированы.

Новые белковые продукты протокадгеринов настоящего изобретения могут быть получены в виде изолятов из натуральных тканевых источников, но предпочтительно их получают с помощью рекомбинантной техники, предусматривающей использование хозяйских клеток настоящего изобретения. В зависимости от выбранных хозяйских клеток или способов рекомбинантного продуцирования и/или последующего выделения указанные белковые продукты могут быть получены в полностью или частично гликозилированной форме, в частично или целиком дегликозилированной форме, или негликозилированной форме.

В соответствии с настоящим изобретением, варианты протокадгеринов могут представлять собой полипептидные аналоги, в которых делетированы или заменены одна или несколько конкретных аминокислот, либо в которых добавлены одна или несколько искусственно кодированных аминокислот, в результате чего: (I) могут быть потеряны, в предпочтительно, усилены одна или несколько из биологических активностей или иммунологических свойств, характерных для протокадгерина; или (2) может быть утрачена способность к специфическому связыванию с конкретным лигандом/антилигандом. В настоящем изобретении также рассматриваются антитела (например, моноклональные и поликлональные антитела, химерные и "очеловеченные" антитела, домены антител, включая Fab, Fаb^', F(ab')₂, Fv или отдельные вариабельные области, и одноцепочечные антитела), которые являются специфическими для протокадгеринов настоящего изобретения. Указанные субстанции антител могут быть продуцированы с использованием выделенных натуральных, рекомбинантных или синтетических полипептидных продуктов протокадгерина, либо с использованием хозяйских клеток, экспрессирующих указанные продукты на своей поверхности. Эти субстанции антител могут быть использованы для очистки полипептидов протокадгерина настоящего изобретения в целях определения тканевой экспрессии полипептидов, а также в качестве антагонистов по отношению к активностям связывания протокадгеринов с лигандом/антилигандом. Конкретно проиллюстрированные моноклональные антитела настоящего изобретения представляют собой моноклональные антитела против протокадгерина-43, продуцированные с помощью гибридомной клеточной линии, обозначенной 3812C, и депонированной в АТСС 2 декабря 1992 под номером допуска АТСС НВ 11207.

Множество других аспектов и преимуществ настоящего изобретения будут очевидны из нижеследующего подробного описания изобретения, проиллюстрированного конкретными чертежами IA-C, на которых показан сравнительный анализ линейных аминокислотных последовательностей протокадгеринов настоящего изобретения, линейных аминокислотных последовательностей N-кадгерина, и последовательности гена-супрессора опухолевого роста fat дрозофилы.

Подробное описание изобретения Настоящее изобретение проиллюстрировано нижеследующими примерами, где в примерах 1, 2 и 3 описано выделение полинуклеотидных последовательностей протокадгерина с помощью полимеразно-цепной реакции (PCR). В примере 3 также описана хромосомная локализация некоторых генов протокадгерина настоящего изобретения. В примере 4 описано выделение дополнительных полинуклеотидных последовательностей протокадгерина настоящего изобретения с помощью ДНК/ДНК-гибридизадии. В примере 5 описываются конструирование экспрессирующих плазмид, содержащих полинуклеотиды, кодирующие протокадгерин-42 или протокадгерин-43; и трансфекция L-клеток этими плазмидами. Продудирование антител против протокадгерина-42 и протокадгерина-43 описано в примере 6. В примере 7 представлены результаты иммуноанализа трансфецированных L-клеток на экспрессию протокадгерина-42 или протокадгерина-43. В примере 8 описана способность L-клеток, трансфецированных протокадгерином-42, протокадгерином-43, или химерной молекулой "протокадгерин-43/Е-кадгерин", образовывать клеточные агрегации. В примере 9 описаны кальцийсвязывающие свойства рс43. В примерах 10, 11 и 12 представлены результаты анализов различных тканей и клеточных линий на экспрессию протокадгерина-42 и протокадгерина-43 с использованием Нозерн-блоттинга, Вестерн-блоттинга и in situ-гибридизации соответственно. В примере 13 описаны эксперименты с помощью иммунопреципитации, в которых был идентифицирован 120 кДа-белок, совместно осаждающийся с протокадгерином-43.

Пример 1.

Для выделения новых фрагментов кДНК крысы, кодирующих кадгерин-родственные полипептиды, использовали полимеразно-цепную реакцию (PCR).

Построение PСR - праймеров.

Две области консервативной аминокислотной последовательности, одна из середины третьего внеклеточного субдомена кадгерина (ЕC-3), а другая из С-конца четвертого внеклеточного субдомена (ЕС-4), были идентифицированы путем сравнения известных аминокислотных последовательностей для L-CAM ( Gallin и др., см. выше), Е-кадгерина (Hagafuchi и др., см. выше), мышиного Р-кадгерина ( Nose и др., см. выше), увоморулина ( Ringwald и др., см. выше), куриного N -кадгерина ( Hatta и др., см. выше; мышиного N-кадгерина (Miyatani et al., Science, 245: 631-635 (1989)) и Р-кадгерина человека (Shimoyama et al., J. Cell. Biol., 109: 1787-1794 (1989)), в результате чего для использования в качестве PCR-праймеров были сконструированы соответствующие вырожденные олигонуклеотиды, представленные ниже в соответствии с биохимической номенклатурой IUPAC-IUB: Праймер 1 (SEQ ID NO:1) 5' AARSSNNTNGAYTRYGA 3' Праймер 2 (SEQ ID NO: 2) 3' TTRCTRTTRCGNGGSNNN 5'
Вырожденные олигонуклеотиды были синтезированы с использованием ДНК-синтезатора модели 380В Applied Biosystems (Foster City, California).

Клонирование кДНК-последовательностей с помощью полимеразной цепной реакции (PCR)
Полимеразно-цепную реакцию осуществляли способом, описанным в работе Suzuki и др. (Cell Regulation, 2: 261-270,(1991) с использованием кДНК-препаратов крысиного головного мозга. Полную ДНК получали из головного мозга крысы методом, использующим изотиоцианат гуанидиния/хлорид цезия, и описанным Маниатисом и др. (стр. 196) в "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Hew Yorkt Cold Spring Harbor Laboratory (1982). Затем с использованием набора FastTrack®(Invitrogen, San Diego, California ) выделяли poly(A)⁺-РНК головного мозга, и получали кДНК с использованием набора для синтеза ДНК (Boehringer Mannheim Biоchemicals, Indianapolis, Indianas), полимеразно-цепную реакцию инциировали путем добавления 2,5 ед. ДНК-полимеразы Taq (Boehringer Mannheim Biochemicals) к 100 нг матричной кДНК и 10 мг каждого праймера, после чего осуществляли 35 реакционных циклов, состоящих из денатурации (94^oС, 1,5 мин), отжига (45^oС, 2 мин), и полимеризации (72^oС, 3 мин). Продукты PCR-реакции подвергали электрофорезу на агарозном геле, в результате чего были обнаружены две большие полосы размером около 450 пар оснований (п. о.) и 130 пар оснований (п.о.). 450 п.о.- полоса соответствовала ожидаемой длине последовательности между двумя праймерными участками, соответствующими середине третьего внеклеточного субдомена (ЕС-3) кадгерина, и карбокси-концу четвертого внеклеточного субдомена (ЕС-4) кадгерина; однако 130 п.о. - полоса не соответствовала какой-либо из предварительно идентифицированных последовательностей кадгерина. Эти 450 п.о.- и 130 п.о.-полосы экстрагировали методом замораживания и оттаивания. Полученные фрагменты фосфорилировали у 5'-конца с помощью полинуклеотидкиназы Т4, и субклонировали В Sma1-сайт M13mp18 (Boehringer Mannheim Biochemicals ) путем лигирования по тупым концам для анализа последовательностей. Секвенирование фрагментов осуществляли методом дидезоксинуклеотидтерминации цепи с использованием секвеназного набора (Sequenase kit)(United States Biochemicals, Cleveland, Ohio). ДНК- и аминокислотную последовательность анализировали с использованием программы Beckman Microgenie (Fullerton, California).

Анализ кДНК-последовательностей
Было выделено 19 новых неполных кДНК-клонов. Ниже представлены ДНК-последовательности и выведенные аминокислотные последовательности клонов (включая последовательности, соответствующие PCR -праймерами: RAT-123 ( SEQ ID 3 и 4 соответственно), RAT-212 (SEQ ID 5 и 6), RAT-214 (SEQ ID 7 и 8), RAT-216 (SEQ ID 9 и 10), RAT-218 (SEQ ID 11 и 12), RAT-224 (SEQ ID 13 и 14), RAT-312 (SEQ ID 15 и 16), RAT-313 (SEQ ID 17 и 18), RAT-314 (SEQ ID 19 и 20), RAT-315 (SEQ ID 21 и 22), RAT-316 (SEQ ID 23 и 24), RAT-317 (SEQ ID 25 и 26), RAT-321 (SEQ ID 27 и 28), RAT-323 (SEQ ID 29 и 30), RAT-336 ( SEQ ID 31 и 32), RAT-352 ( SEQ ID 33 и 34), RAT-411 (SEQ ID 35 и 36), RAT-413 (SEQ ID 37 и 38) и RAT-551 (SEQ ID 39 и 40.

Выведенные аминокислотные последовательности кДНК-клонов являются гомологичными известным кадгеринам, но отличаются от них. Описанные до настоящего времени кадгерины имеют в высокой степени консервативные короткие аминокислотные последовательности в третьем внеклеточном субдомене (EС-3), включая консенсусную последовательность D-Y-E или D-F-E, расположенную в середине субдомена, и консенсусную последовательность D-X-N-E-X-P-X-F (SEQ ID 41) или D-X-D-Е-X-P-X-F (SEQ ID 42) в его конце (Hatta и др., см. выше); а также соответствующие последовательности других субдоменов за исключением пятого внеклеточного субдомена (ЕС-5), а именно D-R-E и D-X-N-D-N-X-P-X-F (SEQ ID 43) соответственно. В противоположность этому выведенные аминокислотные последовательности новых клонов, соответствующие внеклеточным субдоменам кадгерина, имеют последовательность D-Y-E или D-F-E на одном конце, и последовательность D-X-N-D-N-X-P-X-F вместо последовательности D-X-N-E-X-P-X-F или D-X-D-E-X-P-X-F на другом конце. Полипептиды, кодированные неполными клонами, гомологичны ранее идентифицированным кадгеринам, однако, они не обнаруживают значительной гомологии с любыми другими последовательностями, имеющимися в банке генов (Genbank). Поэтому эти частичные кДНК представляют новый подкласс кадгерин-родственных молекул.

Пример 2.

Различные кДНК-фрагменты, структурно схожие с кДНК крысы, описанными в примере 1, были выделены из кДНК-препаратов головного мозга человека, мыши и лягушки (Xenopus), а также из кДНК-препаратов интактных организмов Drosophila и С. elegans посредством полимеразной цепной реакции с использованием праймеров 1 и 2, описанных в примере 1. ДНК-последовательности и выведенные аминокислотные последовательности полученных PCR--фрагментов (включая последовательности, соответствующие PCR-праймерам) представлены следующими последовательностями: MOUSE-321 (мышь) (SEQ ID NOs: 44 и 45), MOUSE-322 (SEQ ID NOs: 46 и 47), MOUSE-324 (SEQ ID NOs: 48 и 49), MOUSE-326 (SEQ ID NOs: 50 и 51), НUMAN-11 (человек) (SEQ ID NOs: 52 и 53), HUMAN-13 (SEQ ID NOs: 54 и 55), HUMAN-21 (SEQ ID NOs: 56 и 57), HUMAN-24 (SEQ ID NOs: 58 и 59), HUMAN-32 (SEQ ID NOs: 60 и 61), HUMAN-42 (SEQ ID NOs: 62 и 63), HUMAN-43 (SEQ ID NOs: 64 и 65), HUMAN-212 (SEQ ID NOs: 66 и 67), HUMAN-213 (SEQ ID NOs: 68 и 69), HUMAN-215 (SEQ ID NOs: 70 и 71), HUMAN-223 (SEQ ID NOs: 72 и 73), HUMAN-410 (SEQ ID NOs: 74 и 75), HUMAN-443 (SEQ ID NOs: 76 и 77), XENOPUS-21 (лягушка) (SEQ ID NOs: 78 и 79), XENOPUS-23 (SEQ ID NOs: 80 И 81), XENOPUS-25 (SEQ ID NOs: 82 и 83), XENOPUS-31 (SEQ ID NOs: 84 и 85), DROSOPHILA-12 (SEQ ID NOs: 86 И 87), DROSOPHILA-13 (SEQ ID NOs: 88 и 89), DROSOPHILA-14 (SEQ ID NOs: 90 и 91) и C.ELEGANS-41 (SEQ ID NOs: 92 и 93). Сравнение выведенных аминокислотных последовательностей выявило значительное сходство между группами этих клонов, В частности, три группы клонов, как было видно из сравнения, обладают межвидовой гомологией, а именно: RAT-218 MOUSE-322 и НUMAN-43; RAT-314, MOUSE-321 и HUMAU-11 и MOUSE-326 И НUMAN-42.

Пример 3.

Для определения полной структуры новых белков, представленных PCR-продуктами, были выделены две полноразмерные кДНК человека, соответствующие кДНК HUMAN-42 И НUМАN-43.

Выделение полноразмерных кДНК человека
кДНК-библиотеку, полученную от головного мозга плода человека ( Strtagene. La Jolla, California ) в векторе λ ZapII, скринировали методом гибридизации бляшек (описанным в Ausubel et al., Eds., Current Protocols in Molecular Biology, Sections 6.1.1 -6.1.4 and 6.2.1-6.2.3, John Wiley & sons. New York (1987)) c ³²P-меченными ДНК-фрагментами HUMAN-42 и HUMAN-43. Позитивные клоны были очищены методом бляшек и с использованием вируса-помощника вставки разрезали методом in vivo-эксцизии в виде плазмиды Blues-cript sk(+). Затем последовательности вставок субклонировали в вектор M13 (Boehrlinger Mannheim, Biochemicals ) для секвенирования. Было выделено несколько перекрывающихся кДНК-клонов с использованием каждого из них в качестве зонда, включая две кДНК, которые содержали предлагаемые полные кодирующие последовательности двух новых белков, обозначенных протокадгерином-42 (рс42) и протокадгерином-43 (рс43). ДНК и выведенные аминокислотные последовательности рс42 представлены в SEQ ID 94 и 95 соответственно, а ДНК и выведенные аминокислотные последовательности рс43 представлены в SEQ ID 96 и 97 соответственно.

Описание клонирования последовательностей протокадгерина настоящего изобретения опубликовано в работе Sano и др., (The EMВО Journal, 12(6): 2249-2256 (1993)) после подачи приоритетной заявки на это изобретение. Выведенная аминокислотная последовательность рс43 была предварительно представлена на заседании Американского общества по клеточной биологии, состоявшегося 9 декабря 1991 г. Реферат этого сообщения был опубликован в ^"Suzuki" et al., J. Cell. Biol., 115: 72a (Abstract 416) (December 9, 1991).

Анализ полноразмерных человеческих клонов
Сравнение полноразмерных кДНК-последовательностей рс42 и рс43 с последовательностями различных ДНК-фрагментов, первоначально полученных с помощью полимеразной цепной реакции показало, что последовательности MOUSE-326 и HUMAN-42 соответствуют части четвертого внеклеточного субдомена (EС-2) рс42; последовательности RAT-314, Mouse-321 и HUMAN-11 соответствуют части третьего внеклеточного домена (EС-3) рс43; а последовательности RAT-218, MOUSE-322 И HUMAN-43 соответствуют части пятого внеклеточного домена (ЕС-5) рс43.

Полная структура рс42 и рс43 аналогична структуре типичных кадгеринов, однако, новые молекулы имеют также и заметные отличительные признаки. кДНК-последоватедьности обоих протокадгеринов содержат предлагаемые сайты инициации трансляции и точки инициации синтеза транслированных аминокислотных последовательностей с типичными сигнальными последовательностями, однако, в этих клонах отсутствуют пропоследовательности, имеющиеся во всех известных предшественниках кадгеринов, кДНК-последовательности кодируют белки, имеющие крупный N-концевой внеклеточный домен и относительно короткий С-концевой цитоплазматический домен, соединенные трансмембранной последовательностью. Внеклеточные домены рс42 и рс43 отличаются по своей длине; при этом рс42 содержит семь субдоменов, которые обладают близким сходством с внеклеточным субдоменом типичного кадгерина, а рс43 содержит шесть таких субдоменов. Цитоплазматические домены протокадгеринов имеют такие же размеры, что и цитоплазматические домены типичных кадгеринов, однако, последовательности этих доменов не обнаруживают какой-либо значительной гомологии с цитоплазматическими доменами известных кадгеринов и кадгерин-родственных белков.

Определения идентичности аминокислотных последовательностей внеклеточных субдоменов рс42 и рс43 человека и мышиного N-кадгерина (SEQ ID 98) (представленного в качестве "типичного" кадгерина), а также восемнадцатого внеклеточного субдомена, супрессора опухолевого роста fat Drosophila (ЕС-18, SEQ ID и 99)(этот восемнадцатый внеклеточный субдомен супрессора fat представляет собой прототипический fat - субдомен) приводятся ниже в таблице 1, где, например, N-ЕС-1 х рс42" означает, что первый внеклеточный субдомен N-кадгерина сравнивается с внеклеточным субдоменом рс42, показанным на горизонтальной оси.

Степень идентичности аминокислотных последовательностей внеклеточных субдоменов рс42 и рс43, и внеклеточных субдоменов EС-1 - ЕС-5 N-кадгерина и внеклеточного субдомена ЕС-18 fat Drosophila составляет, в основном, менее чем 40%. Эти значения идентичности сравнимы со значениями идентичности между субдоменами других подклассов кадгеринов. Однако более высокие значения степени идентичности указывают на то, что рс42 и рс43 имеют более близкое родство с fat, чем с N-кадгерином.

Определения идентичности аминокислотных последовательностей внеклеточных субдоменов рс42 и рс43 человека представлены в таблице 2.

Значения степени идентичности соответствующих субдоменов EС-1, ЕС-2, EС-3, EС-4, EС-5 и последних субдоменов рс42 и рс43 обычно выше значений, полученных при сравнении протокадгеринов с N-кадгерином. Эти результаты дают основание предположить, что рс42 и рс43 имеют более близкое родство между собой, чем с другими классическим кадгеринами.

На чертежах IA-IC представлен сравнительный анализ выведенных линейных аминокислотных последовательностей внеклеточных субдоменов pc 42(ЕС-1 - ЕС-7), рс43 (EС-1 - EС-6), мышиного N-кадгерина (EС-1-EС-5) и EС-18 fat Drosophila. Последовательность, изображенная на какой-либо строке фиг. IA, продолжается на той же самой строке на фиг. IВ и IC. Пробелы в последовательностях введены в целях максимизации гомологии. Аминокислотные остатки, обозначенные заглавными буквами в строке под заголовком "мотив", присутствуют более чем в половине субдоменов N-кадгерина, рс42, рс43 и fat Drosophila. Аминокислотные остатки, обозначенные строчными буквами в строке "мотив", являются гораздо менее консервативными в рс42 и рс43 человека и fat Drosophila. На фиг. IA-IC показано, что многие аминокислоты, характерные для других повторов внеклеточных доменов кадгеринов, являются консервативными в последовательностях рс42 и рс43, включая мотивы последовательностей кадгерина DXD, DRE и DXNDNXPXP (SEQ ID 43), два глициновых остатка, и один остаток глутаминовой кислоты. Кроме того, по сравнению с N-кадгрином, рc42 и рс43 имеют общие уникальные признаки. Другие аминокислоты в специфических участках являются консервативными с рс42 и рс43, например, таких как последовательность мотива протокадгерина DXDXGXN (SEQ ID 100), расположенная возле аминоконца субдоменов рс42 и рс43, и последовательность мотива AXDXGXP (SEQ ID 101), расположенная возле карбоксиконца субдоменов. Кроме того, оба протокадгерина имеют общие области, которые не обнаруживают значительной гомологии с мотивом типичного кадгерина ( N-кадгерина), расположенного возле карбоксиконца ЕС-1, в середине ЕС-2 и ЕС-4, и у карбоксиконца последнего повтора. Цистеиновый остаток расположен в одинаковых положениях в середине ЕС-4 рс42 и рс43. В основном, внеклеточные субдомены рс42 и рс43 имеют большее сходство с EС-18 fat, чем с внеклеточными субдоменами N-кадгерина.

Возможный альтернативный сплайсинг
Анализ последовательностей различных перекрывающихся кДНК-клонов протокадгеринов выявил, что некоторые клоны содержат уникальные последовательности у 3'-конца, тогда как последовательности 5'-конца были идентичны другим клонам. Последовательности, образующие границы 3'-концевых областей, соответствуют консенсусной последовательности сплайсинга мРНК, что дает основание предположить, что эти клоны могут соответствовать альтернативно сплайсированным мРНК. ДНК-последовательность и выведенная аминокислотная последовательность одного из возможных продуктов альтернативного сплайсинга мРНК рс42 представлены SEQ ID 102 и 103. ДНК- и выведенные аминокислотные последовательности двух возможных продуктов альтернативного сплайсинга мРНК рс43 представлены соответственно в SEQ ID 104 и 105, и в SEQ ID 106 и 107.

Местоположение на хромосоме
Хромосомную локализацию гена протокадгерина 413 (SEQ ID 37) и генов рс42 и рс43 определяли стандартными методами.

Короче говоря, мышей С3Н/HeJ-gld и Mus spretus (Spain) и мышей, полученных путем межвидового обратного скрещивания, [(С3Н/HeJ-gld х Mus spretus)] F₁- х С3Н/HeJ-gld ] скрещивали и содержали, как описано в работе Seldin и др. (J. Exp. Med. , 167: 688-693 (1988)). Мышь Mus spretus выбирали в качестве второго родителя при скрещивании из-за относительно легкого, в этом случае, обнаружения информативного полиформизма длин рестрикционных фрагментов (RFVLs) по сравнению со случаями использования для скрещивания стандартных инбредных лабораторных линий. Сцепление генов определяли путем сегрегационного анализа.

Геномную ДНК, выделенную из мышиных органов с использованием стандартной техники, гидролизовали рестриктирующими эндонуклеазами, и 10 мкг образцов подвергли электрофорезу на 0,9% агарозном геле. ДНК-переносили на нитрановые мембраны (Schleicher & Schull, Inc., Keene, NH ), гибридизовали с соответствующим зондом при 65^oС, и промывали в жестких условиях (все указанные процедуры описаны в пособии Маниатиса и др., см. выше). Для определения локализации гена рс42 в качестве зонда использовали мышиную последовательность, соответствующую нуклеотидам 1419-1906 SEQ ID 94, а для определения локализации гена рс43 использовали в качестве зонда крысиную последовательность, соответствующую нуклеотидам 1060-1811 SЕQ ID 96. Для определения местоположения гена протокадгерина 413 использовали зонд, включающий в себя последовательность, представленную в SЕQ ID 37. Другие клоны, использованные в качестве зондов в настоящем исследовании, и PFLV, используемые для определения местоположения анонимных ДНК, были описаны ранее (Хромосома 7, ДНК-сегмент, Washington 12 (D7Was12); гормон околощитовидных желез (Pth); кальцитонин (Calс); гемоглобин, β-цепь (Hbb); металлотионеин-1 (Mt-1); аденинфосфорибозилтрансфераза (Ghrt); рецептор гормона роста (Ghr); подтип ЕР2 рецептора простагландина Е (Ptgerep2); дигидрофолатредуктаза-2 (Dhfr2); фактор роста фибробластов а (Fgfa); и гликокортикоидный рецептор-1 (Grl-1).

Сравнение распределения гаплотипов протокадгерина с распределением гаплотипов, полученным для локусов генов по всему мышиному геному, дало возможность осуществить картирование каждого гена для специфических областей мышиных хромосом. Вероятность сцепления составляла более чем 99%, что дает основание считать, что ген рс42 и ген рс43 находятся на хромосоме 18. Ген протокадгерина 413 находится на хромосоме 7. Область хромосомы 18, для которой были картированы гены рс42 и рс43, соответствует локусам атаксии (ax) (Burt, Anat. Rec. 196: 61-69 (1980), и Lyon, J.Hered. 46, 77-80, (1955)), и локусам "кручения" (twirler)(Tw) (Lyon, J. Embriol. Exp. Morphol., 6.: 105-116 (1958)), a область хромосомы 7, для которой был картирован ген протокадгерина 413, соответствует локусу "качания" (shaker) (sh-1) (Kikuchi et al., Acta Oto-Laryngol., 60.: 287-303 (1965) и Lord et al., Am. Nat., 63,: 453-442 (1929)). Считается, что гены в этих локусах причастны к наследственным неврологическим расстройствам у мышей. Полученный результат согласуется с результатами, полученными методом гибридизации in situ (см. пример 12), что свидетельствует о том, что рс42 и рс43 экспрессируются только в головном мозге, в частности в мозжечке.

Пример 4.

С использованием в качестве зондов фрагментов протокадгерина крысы, описанных в примере 1, были выделены еще две новые кДНК протокадгерина человека и еще одна новая кДНК прокадгерина крысы.

Сначала, для скрининга кДНК-библиотеки головного мозга крысы ( Stratagene, La Jolla, CA) использовали в качестве зонда крысиный клон RАТ-214 (SEQ ID 7). Конечную стадию промывки осуществляли дважды в 0,1 х SSC с 0,1% ДСН при 50^oС, в течение 15 минут. Были идентифицированы различные клоны, которые содержали неполные кДНК-вставки, кодирующие родственные аминокислотные последовательности протокадгеринов. Нуклеотидная последовательность одного нового крысиного клона, обозначенного # 6-2, представлена в SEQ ID 108. Первые пятнадцать нуклеотидов в SEQ ID 108 представляют собой последовательность линкера и не являются частью крысиного клона # 6-2.

кДНК-библиотеку головного мозга плода человека, подученную от Stratagene, скринировали с использованием 0,7 т.п.о. -Pst1 -фрагмента клона # 6-2. Этот фрагмент, очевидно, кодирует ЕС-2 и ЕС-3 протокадгерина крысы. После скрининга около 2•10⁶ фагов было выделено одиннадцать позитивных клонов. В результате секвенирования этих клонов была идентифицирована новая полноразмерная кДНК протокадгерина человека, обозначенного чел.рс3). Нуклеотидная и выведенная аминокислотная последовательности чел. рс3 представлены в SEQ ID 109 и 110.

0,7 т.п.о.- PstI - фрагмент крысиного клона # 6-2 был также использован для повторного скрининга кДНК-библиотеки головного мозга крысы (Stratagene) в целях выявления полноразмерных кДНК-клонов крысы. Был выделен клон, содержащий вставку, кодирующую полноразмерную новую кДНК протокадгерина. ДНК- и выведенная аминокислотная последовательности вставки представлены в SEQ ID 111 и 112. Полноразмерная кДНК крысы была обозначена рс5, поскольку она не является гомологом клона на чел.рс3, как это было видно из сравнения этих последовательностей.

Параллельно с этим для зондирования чел.кДНК-библиотеки ( Stratagene ) в целях выявления полноразмерных кДНК-протокадгерина человека был использован 0,8 т. п. о.- EcoRI-PstI -фрагмент неполной кДНК крысы, обозначенной # 43 ( SEQ ID 113), которой был получен путем скрининга кДНК головного мозга крысы (Stratagene) с помощью зонда, соответствующего цитоплазматическому домену чел. рс43. Этот фрагмент, очевидно, кодирует участок от EС-3 до начала EС-6 клона # 43. Один идентифицированный частичный клон кодирует новый протокадгерин человека, обозначенный чел.рс4. Нуклеотидная последовательность и выведенная аминокислотная последовательность клона чел.рс4 представлены в SEQ ID 114 и 115. Аминокислотная последовательность, кодированная клоном рс4, начинается, очевидно, в середине ЕС-2 рс4 и простирается до цитоплазматического конца протокадгерина включительно.

Пример 5.

Полноразмерные кДНК человека, кодирующие рс42 и рс43, были экспрессированы в L-клетках (АТСС ССL 1 ) с использованием экспрессирующего вектора pRC/RSV (Invitrogen, San Diego, California). кДНК были выделены из Bluescript SK(+) -клонов, описанных в примере 2, путем гидролиза ферментом Ssp1 с последующим затупленном концов с помощью ДНК-полимеразы и гидролиз ферментом XbaI (для рс42), либо путем двойного гидролиза ферментами SpeI и EcoRV (для рс43). Экспрессирующий вектор pRS/RSV гидролизовали ферментом Hind III, затем затупляли по концам, и снова гидролизовали ферментом XbaI для встраивания последовательностей рс42; либо гидролизовали ферментом XbaI, затем затупляли по концам, и снова гидролизовали ферментом SpeI для встраивания последовательностей рс43. Ввделенные ДНК протокадгеринов лигировали в линеаризованный вектор pRC/RSV. Полученные рс42-экспрессирующую плазмиду, обозначенную pRC/RSV-pc42 (ATCC 69162), и рс43-экспрессирующую плазмиду, обозначенную pRC/RSV-pc43 (ATCC 69163), очищали путем центрифугирования в градиенте CsCl, и трансфецировали в L-клетки Са-фосфатным методом.

рс42 и рс43-трансфектанты имели морфологическое сходство с родительскими клетками. Нозерн-блот-анализ L-клеток, трансфецированных рс42- или рс43-ДНК-последовательностями, показал, что трансфецированные клетки экспрессировали мРНК, имеющие размеры, ожидаемые для кодируемого конкретного протокадгерина.

Пример 6.

Были продуцированы кроличьи поликлональные антитела, направленные против рс42 и рс43, а также мышиное моноклональное антитело, направленное против рс43.

Получение поликлональных антител против рс42 и pc43
ДНК-последовательности, кодирующие части внеклеточного домена рс42 и рс43, каждую, лигировали с последовательностью, кодирующей белок, связывающийся с мальтозой, и экспрессировали в бактериях. В частности, ДНК, соответствующие доменам ЕС-4 - ЕС-7 протокадгерина рс42 и доменам ЕС-3 - ЕС-5 протокадгерина рс43, получали с помощью полимеразной цепной реакции, и субклонировали в правильной рамке считывания в сайт мультиклонирования экспрессирущего вектора рМАL ( New England Biolabs, Beverly, Massachusetts ), который содержит последовательности, кодирующие белок связывания с мальтозой, и расположенные непосредственно выше сайта мультиклонирования. Полученные плазмиды затем вводили в клетки NМ522 E.coli (Invitrogen, San Diego, California) методом одностадийной трансформации. Экспрессию гибридных белков индуцировали путем добавления 1PTG, и гибридные мелки очищали от клеточных экстрактов с помощью аффинной хроматографии на амилозной смоле (New England Biolabs), как описано в инструкции производителя. Полученные гибридные белки использовали для иммунизации кроликов без дополнительной очистки.

Поликлональные антитела продуцировали у кроликов путем иммунизации, которую проводили посредством подкожных инъекций (в четыре различных участка) 500 мкг очищенного гибридного белка в полном адъюванте Фрейнда. При последующих иммунизациях использовали 100 мкг гибридного белка в неполном адъюванте Фрейнда. иммунную сыворотку пропускали через сефарозу, связанную с мальтозо-связывающим белком ( New England Biolabs ), и поликлональные антитела очищали от иммунной сыворотки с использованием аффинных колонок на сефарозе, приготовленных с помощью реакции очищенного гибридного белка с CNBr-активированной сефарозой ( Pharmacia ). Реакционная способность поликлональной сыворотки по отношению к очищенному рс42-гибридному белку и рс42-трансфецированным клеточным экстрактам (описанным в Примере 5) подтвердилась.

Получение моноклональных антител против рс43
рс43-гибридный белок (содержащий субдомены EС-3 - EС-5 протокадгерина рс43) использовали для продуцирования моноклональных антител у мышей в соответствии с методом Kennett ( Methods in Enzymol., 58: 345-359 (1978). Для этого, мышей иммунизировали путем подкожных инъекций (в два участка тела животного) рс43-гибридного белка (100 мкг). Клетки селезенки, взятой от мыши с самым высоким титром, подвергали слиянию с клеточной линией миеломы NS1. Гибридомные надосадочные фракции скринировали с помощью ELISA -анализа на реактивность с рс43-гибридным белком и с мальтозо-связывающим белком. Лунки для слияния, имеющие наиболее высокую реактивность по отношению к внеклеточным доменам рс43, подвергали субклонированию. Гибридомная клеточная линия, обозначенная 3812C (ATGC HB 11207), продуцировала моноклональные антитела подтипа IgG₁ против рс43. Реактивность моноклональногo антитела, продуцированного гибридомной клеточной линией 3812C, по отношению к рс43 была подтверждена путем иммуноблоттинга L-клеточных рс43-трансфектантов, описанных в примере 5. Моноклональное антитело 3812C являлось антителом против рс43 человека.

Пример 7.

L-клетки, трансфецированные рс42- и рс43-кодирующим ДНК-последовательностями, полученными как описано в Примере 5, анализировали на экспрессию протокадгеринов с помощью иммуноблоттинга и иммунофлуоресцентной микроскопии.

Анализ путем иммуноблоттинга
Клеточные экстракты рс42- и рс43-трансфектантов подвергали ДСН-электрофорезу в ПААГ, а затем подвергали электрофоретическому блотированию на мембрану PVDF (Millipore, Bedford Massachusetts). Мембраны в течение 2 часов инкубировали с 5% сепарированным молоком в забуференном трисом физиологическом растворе (TBS), а затем в течение одного часа инкубировали соответственно либо с поликлональной сывороткой против рс42, либо с моноклональным антителом против рс43. После этого мембраны промывали три раза (каждый раз по 5 минут) TBS, содержащим 0,05%-ный Твин 20, и соответственно инкубировали в течение 1 часа в одном и том же буфере с антителом против кроличьих IgG, конъюгированным со щелочной фосфатазой, либо с антителом против мышиных IgG (Promega, Madison, Wisconsin). После промывки мембран ТBS, содержащим 0,05% Твин 20, реактивные полосы визуалировали с использованием раствора голубого Вестерн (Рromega).

Поликлональные антитела против рс42 окрашивали полосу с молекулярной массой около 170 кДа в рс42-трансфецированных клетках, но не в родительских L-клетках. Моноклональное антитело против рс43 (3812G) и поликлональные антитела окрашивали две соседние полосы с молекулярной массой около 150 кДа в рс43-трансфецированных клетках. Антитела против рс43 не окрашивали полосы в родительских L-клетках. Молекулярные массы, выявленные путем окрашивания полос с помощью антител против рс42 и рс43, оказались значительно больше, чем молекулярные массы, предсказанные исходя из выведенных аминокислотных последовательностей. Такое расхождение в молекулярных массах является обычным среди различных кадгерин-родственных белков и может быть отнесено за счет гликозилирования и/или кадгерин-специфических структурных свойств.

Антитело против рс42 также окрашивало и более мелкие полосы, которые могут представлять собой продукты протеолитической деградации.

При трипсинизации трансфецированных клеток и получении клеточных экстрактов с последующим ДСН-электрофорезом в ПААГ и иммуноблотированием с соответствующим антителом было обнаружено, что рс42- и рс43-полипептиды, экспрессируемые трансфецированными клетками, обладают высокой степенью чувствительности к протеолизу и легко подвергаются гидролизу при обработке 0,01%-ным трипсином. Однако в отличие от классических кадгеринов эти белки не были защищены от гидролиза в присутствии 1-5 мМ Са²⁺.

Иммунофлуоресцентная микроскопия
Трансфецированные клетки культивировали на покровном стекле, предварительно покрытом фибронектином, а затем при комнатной температуре в течение 5 минут проводили фиксацию 4%-ным параформальдегидом; либо эти клетки выдерживали с холодным метанолом на льду в течение 10 минут с последующей фиксацией 4%-ным параформальдегидом. После промывания ТBS, клетки инкубировали с TBS, содержащим 1% BSA, в течение 30 минут, а затем в течение 1 часа при комнатной температуре инкубировали с поликлональным антителом против рс42, или с моноклональным антителом против рс43 в TBS, содержащем 1% BSA. После этого покровные стекла промывали TBS, содержащим 0,01% BSA, и в течение 60 минут при комнатной температуре инкубировали, соответственно, с FITC-конъюгированным антикроличьим антителом, или с антимышиным антителом ( Cappel, Durham, North Carolina. Затем клетки снова промывали TBS, содержащим 0,01% BSA, и подвергали флуоресцентной микроскопии. Поликлональные антитела против рс42 и рс43 окрашивали трансфецированные клетки, экспрессирующие протокадгериновые белки, по периферии, главным образом, в местах межклеточных контактов. Причем эти антитела не окрашивали родительские L-клетки, а кроличья неимунная сыворотка не окрашивала рс42- и рс43-трансфектантов.

Пример 8.

Была оценена способность трансфецированных L-клеток, экспрессирующих протокадгериновые белки, образовывать клеточные агрегации. Трансфецированные L-клетки культивировали в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла (МЕМ) (Gioco, Grand Island, New York), дополненной 10%-ной фетальной бычьей сывороткой, при 37^oС и в присутствии 5% CO₂. Клетки, культивированные до состояния, близкого к сплошности, обрабатывали 0,01%-ным трипсином в присутствии 1 мМ ЕGTA в течение 25 минут на роторном шейкере при 37^oС, и собирали путем центрифугирования. Затем после добавления соевого ингибитора трипсина, клетки три раза промывали HEPES -забуференным физиологическим раствором (HBS), не содержащим Са²⁺, и ресуспендировали в HBS, содержащем 1% BSA. Анализ на агрегацию клеток ( Urushihara et. al., Dev. Bio., 70: 206-216 (1979)) осуществляли путем инкубировании ресуспендированных клеток в смеси (1:1) DMEM и HBS, содержащего 1% BSA, 2 мМ CaGl₂ и 20 мкг/мл дезоксирибонуклеазы, на роторном шейкере, в течение периода времени от 30 минут до 6 часов, при 37^oС.

В течение периодов инкубации менее 1 часа, рс42- и рс43-трансфектанты не обнаруживали какой-либо заметной активности к клеточной агрегации. Этот результат контрастирует с результатами, полученными в аналогичных экспериментах с классическими кадгеринами, у которых наблюдалась способность к клеточной агрегации (Nagafuchi и др., см. выше, и Hatta и др., см. выше). Однако продолжительное инкубирование трансфецированных клеток (более 1-2 часов) приводит к постепенной реагретации клеток в небольшие скопления. Аналогичные результаты были получены с использованием одноклеточных суспензий трансфецированных клеток, приготовленных путем обработки трипсином в присутствии Са²⁺. При тестировании в тех же самых условиях нетрансфецированных L-клеток, или L-клеток, трансфецированных лишь одним вектором pRC/RSV, какой-либо реагрегации не наблюдалось. При инкубировании рс43-трансфектантов, меченных DiO ( Molecular Рrоbе, Eugene, OR ), с немеченными рс42-трансфектантами, в анализе на агрегацию клеток, агрегации меченных и немеченных клеток почти взаимно исключали друг друга, свидетельствуя о том, что связывание протокадгерина является гомофильным.

Bluescript sk(+) -клон, описанный в примере 2. и содержащий полную кодирующую последовательность для рс43, гидролизовади ферментом EcoRI, а затем частично гидролизовали ферментом XbaI для удаления последовательности, соответствующей цитоплазматическому домену, после чего плазмидную ДНК очищали с помощью электрофореза на агарозном геле. кДНК, соответствующую цитоплазматическому домену мышиного Е-кадгерина, синтезировали путем полимеразной цепной реакции с использованием мышиной кДНК, полученной из мРНК мышиного легкого в качестве матрицы, и с использованием специфических праймеров, соответствующих области, лежащей близ N-конца последовательности цитоплазматического домена, или области, содержащей стоп-кодон мышиного Е-кадгерина (Nagafuchi и др., см. выше). XbaI -сайт был введен в место, расположенное до 5'-конца вышележащего праймера. Затем кДНК цитоплазматического домена Е-кадгерина субклонировали в линеаризованный Bluescript-клон рс43. ДНК, содержащую полученную полную химерную последовательность, разрезали ферментами SpeI и EcoRV, и субклонировали в SpeI -затупленный XbaI-сайт экспрессирующего вектора, pRC/RSV и, наконец, L-клетки трансфецировали полученной конструкцией с использованием кальций-фосфатного метода. После скрининга с помощью G418 в течение около 10 дней трансфектанты были окрашены FACS (флюоресцеин-изотиоцианат)-меченным антителом 3812С против рс43 и подвергнуты FACS-анализу (FACS - флуоресцентный метод разделения клеток). Часть клеток с высокой степенью мечения выделяли и клонировали. Трансфектанты обнаруживали морфологическое сходство с родительскими L-клетками, а экспрессированный белок локализовался по периферии клеток, как показал анализ с использованием антитела против рс43 и иммунофлуоресцентной микроскопии.

Способность химерных трансфектантов к клеточной агрегации анализировали следующим образом. Химерные рс43-трансфектанты были подвергнуты мечению DiO в течение 20 минут при комнатной температуре. Полученные клетки трипсинизировали в присутствии 1 мМ EGTA, и приготавливали одноклеточную суспензию. Затем клетки смешивали с немеченными трансфектантами другого типа и инкубировали в течение 2 часов на роторном шейкере. Полученные результаты оценивали с помощью аппаратуры для флуоресцентной и фазово-контрастной микроскопии. Ингибирование антителом клеточной агрегации оценивали путем инкубирования трансфектантов в присутствии поликлонального антитела против рс43 (100 нг/мл) в стандартной cреде для количественного анализа.

В анализе на агрегацию клеток, химерные рc43-трансфектанты обнаруживали явную Са²⁺-зависимую клеточную агрегацию за 40-минутный период инкубирования. Агрегация клеток ингибировалась при добавлении поликлонального антитела против рс43.

Пример 9.

Для определения кальцийсвязывающих свойств рс43 с помощью Вестерн-блот-анализа в присутствии и в отсутствие кальция-45 была использована методика Maruyama и др. ( J. Biochem. 95: 511-519 (1984)). Гибридный рс43-белок, описанный в примере 6, и содержащий субдомены ЕС-3 - ЕС-5 рс43, сравнивали с кальцийсвязывающим белком, кальмодулином. Образцы очищенного рс43-гибридного белка подвергали ДСН-электрофорезу в ПААГ и электрофоретически переносили на PVDF-мембрану. Связывание ⁴⁵Са²⁺ с рс45-гибридным белком обнаруживали с помощью авторадиографии, и определяли насколько эффективность этого связывания близка к эффективности связывания -⁴⁵Са²⁺ с кальмодулином. В противоположность этому, связывания кальция с очищенным мальтозо-связывающим белком, не содержащим внеклеточного домена рс43, не наблюдалось. Субдомены EС-3 - EС-5 протокадгерина рс43 содержат последовательности, являющиеся в высокой степени гомологичными по отношению к предлагаемым Са²⁺-связывающим мотивам, найденным в E-кадгерине (см., Ringwald et al., ЕMBO J. 6: 3647-3653 (1987)).

Пример 10.

С помощью Нозерн-блот-анализа оценивали экспрессию мРНК, кодирующей рс42 и рс43, в различных тканях и клеточных линиях. Полные РНК получали методом с использованием изотиоцианата гуанидиния, и с помощью набора FastTrack® (Invitrogen) выделяли poly(А) + РНК. РНК-препараты подвергали электрофорезу на 0,8%-ном агарозном геле в условиях денатурации, а затем переносили на нитроцеллюлозный фильтр капиллярным методом. Нозерн-блот-анализы осуществляли по методу Thomas (Proc. Natl. Acad. Sci. USА, 77: 5201-5205 (1960)). Конечную промывку осуществляли в 0,2 х стандартном нитратном солевом растворе, содержащем 0,1% додецилсульфата натрия, в течение 10 минут при 65^oС.

Экспрессия мРНК протокадгерина в тканях взрослых крыс
Препараты полных мРНК, полученные из тканей крыс, включая головной мозг, сердце, печень, легкие, кожу, почки и мышцы, подвергали электрофоретическому разделению в условиях денатурации (10 мкг мРНК/дорожка) и переносили на нитроцеллюлозные фильтры. Эти фильтры гибридизировали с ³²Р-меченными кДНК-фрагментами MOUSE-326 (которые соответствуют ЕС-4 протокадгерина-42 человека) и RAT-218 (которые соответствуют ЕС-5 протокадегрина-43 человека). мРНК обоих протокадгеринов обнаруживали высокую степень экспрессии в головном мозге. рс42-зонд обнаруживал большую полосу размером 7 т.п.о. и малую полосу размером 4 т.п.о., которая, вероятно, представляет собой продукты альтернативного сплайсинга. рс43-Зонд гибридизировался с большой полосой размером 5 т.п.о. и с малыми полосами меньших размеров.

Временная экспрессия мРНК протокадгерина в головном мозге крысы
Для оценки временной регуляции экспрессии мРНК протокадгеринов из головного мозга крыс, находящихся на эмбриональной стадии развития (17 и 20 дней), новорожденных крыс в возрасте 5 и 11 дней и взрослых крыс, получали мРНК, и эти РНК подвергали Нозерн-блот-анализу, как описано выше для других тканей крыс. В качестве внутреннего стандарта использовали β-актин. По сравнению с экспрессией β-актина уровни мРНК для рс42- и рс43-белков увеличивались по мере эмбрионального развития головного мозга.

Экспрессия мРНК протокадгеринов в клеточных линиях человека
Несколько линий нервных и глиальных клеток (включая клеточные линии нейробластомы SK-N-SH человека, глиомы U251 человека, и нейробластомы Neuro-2a мыши) были подвергнуты Нозерн-блот-анализу на экспрессию ³²Р-меченых мРНК для рс42 и рс43. Клеточные линии человека зондировали кДНК-фрагментами HUMAN-42 (который соответствует субдомену EС-4 рс42 человека) и HUMAN-43 (который соответствует субдомену EС-5 рс43 человека), а мышиные клеточные линии зондировали кДНК-фрагментами MOUSE-326 (который соответствует субдомену EС-4 рс42 человека) и RAT-322 (который соответствует субдомену EC-5 рс43 человека). Было установлено, что клетки нейроблаcтомы человека SK-N-SH и клетки глиомы человека U251 экспрессируют мРНК рс43, а клетки мышиной нейробластомы Neuro-2a экспрессируют мРНК рс42.

Пример 11.

Экспрессию белка рс43 в различных тканях, экстрактах и клетках оценивали с помощью Вестерн-блот-анализа и иммунофлуоресцентной микроскопии.

Экспрессия в экстрактах cердечной мышцы крыс
Экстракт сердечной мышцы крысы в неионогенном детергенте получали путем замораживания сердца в жидком азоте после его удаления с последующим его растиранием в ступке, быстрым измельчением в политроне в 0.5% Nonident P40 в (10 мМ PIPES (рН 6,8), 50 мМ NaCl, 250 мМ NH₄SO₄, 300 мМ сахарозы, 3 мМ MgCl₂) и микроцентрифугированием в течение 15 минут. Образцы подвергали ДСН-электрофорезу в ПААГ и электрофоретически переносили на нитроцеллюлозу (Towbin et al., PNAS, 76: 4350-4354). Методом иммуноблоттинга, описанным в примере 7, с использованием кроличьих поликлональных антител против рс43 обнаруживали два полосы рс43-белка с молекулярными массами 150 и 140 кДа.

Экспрессия в срезах тканей и клетках
Для определения локализации протокадгеринов в различных тканях человеческие и крысиные ткани удаляли, инкубировали в 30%-ной сахарозе в PBS в течение 30 минут при 4^oС и заливали В ОСТ-соединение ( Tissue-Tek, Elkhartt, Indiana ) в пресс-формы для замораживания и быстро замораживали. Срезы тканей в 6 микрон разрезали, и помещали на предметные стекла. Эти предметные стекла промывали фосфатно-буферным раствором (PBS), и в течение 5 минут подвергали фиксации в 3%-ном п-формальдегиде. Для пропитки срезов тканей предметные стекла погружали на 10 минут в ацетон, охлажденный до -20^oС, а затем осушали воздухом. Затем срезы блокировали в течение 30 минут с помощью 2%-ной козьей сыворотки и 1% BSA в PBS, а затем инкубировали с кроличьей поликлональной антисывороткой против рс43 в течение 1 часа при комнатной температуре. Срезы промывали 3 раза в PBS, содержащем 0,1% BSA, и инкубировали в течение 90 минут с биотинилированными антикроличьими антителами (Vector Laboratories, Burlingame, California) в 1% BSA в PBS. После 3-кратного промывания, в течение 30 минут добавляли стрептавидин, конъюгированный с FITC (Vector Laboratories ), а затем снова три раза промывали. Для исследования совместной локализации, соответствующее "первое" антитело использовали с TRITC-конъюгированным "вторым" антителом.

А. Мышца
Иммунологическое определение локализации рс43 в сердечной мышще крысы показало, что локализация рс43 имеет повторяющийся характер, что соответствует ассоциации рс43 с саркомерами. Саркомеры представляют собой повторяющиеся сократительные единицы между fascia adherens в скелетных и сердечных мышцах. Исследование совместной локализации с цитоскелетными белками показало, что рс43 присутствует в концевых участках саркомеров в Z-линиях, которые ассоциируются с белком десмином и с белком винкулином, связывающимся с актином, а также с альфа-актинином. Тонкие микрофиламенты F-актина ассоциируются с толстыми филаментами миозина между Z-линиями. В противоположность этому, N-кадгерин локализуется в концевых частях миоцитов сердца у соединений fascia adherens в местах контакта микоцит:миоцит. Локализация рс43 в сердечной мышце позволяет предположить, что рс43 может играть определенную роль в сокращении мышцы при связывании сократительного аппарата с плазматической мембраной.

Аналогичная локализация рс43 наблюдалась в скелетной мышце крысы. Ультраструктурные исследования показали, что дистрофин, представляющий собой генный продукт, отсутствующий при мышечной дистрофии Дюшенна, является компонентом сарколеммы ( Porter et al., J. Cell. Biol., 117: 997-1005 (1992)). Сарколемма соединяется с сократительным аппаратом в М- и Z-линиях, где локализируется рс43.

В. Головной мозг
Реактивность поликлонального антитела против рс43 и моноклонального антитела 3812C на замороженных срезах мозжечка крысы и человека соответственно указывает на то, что основные области экспрессии рс43 находятся в клетках Пуркинье и в слое гранулоцитов, который содержит многочисленные малые нейроны.

С. Плацента
Сильная реактивность моноклонального антитела 3812C по отношению к синцитиотрофобластам человека также наблюдалась в процессе развития плаценты на ранней стадии беременности (5-7 недель). По мере развития беременности наблюдалось постепенное снижение уровней экспрессии, что свидетельствует о том, что рс43 может участвовать в имплантации оплодотворенных яйцеклеток.

D. Клетки нейробластомы и астроцистомы
Иммуноцитохимическое определение локализации рc43 в клетках нейробластомы SK-N-SH и в клетках астроwистомы UW28 с использованием антител против рс43 выявило точечное распределение рс43 на клеточной поверхности, а в некоторых клетках рс43 локализировался на кончиках тонких удлинений (микрошипиков), отходящих от основания нервных отростков. На участках межклеточного контакта клеток астроwистомы UW28, рс43 был организован в виде ряда параллельных линий. Эти линии начинаются в месте контакта и простираются примерно на 5 микрон. Микрофиламенты F-актина были идентифицированы с использованием родамина-фаллоидина ( Molecular Probes, Eugene, Oregon, как описано в инструкции производителя), что указывает на то, что микрофиламенты в клетке, очевидно, оканчиваются в линейных структурах рс43. которые простираются от края клетки и находятся в местах клеточного контакта.

Исследования, проводимые путем иммуноблотирования рс43-специфическими антителами, показали, что белок с молекулярной массой 140 кДа распознается в клетках нейробластомы человека SK-N-SH и в клетках астроциcтомы UW28
Е. Остеобласты
Иммуноцитохимическое определение локализации рс43 (с использованием моноклонального антитела 3812C) в двух клеточных линиях остеогенной саркомы человека [SaOS (ATCC НТВ 85) и MG-63 (ATCC CPL 1427) ] и в культурах нормальных трабекулярных остеобластах человека [культуральная система, описанная в работе Civitelli et al., J. Clin. Invest., 91: 1888-1896 (1993)] показало, что тип экспрессии рс43 в остеобластах аналогичен типу его экспрессии, наблюдаемому в клетках астроцитомы UW28. В местах клеточного контакта, рс43 организован в виде ряда параллельных линий, которые, очевидно, соответствуют "стрессорному волокну" актина. Кроме того, в некоторых клетках рс43 локализируется, очевидно, на кончиках контактирующих клеточных отростков. С помощью Нозерн-блот-анализа были получены дополнительные свидетельства того, что рс43 экспрессируется в нормальных трабекулярных остеобластах человека. рс43-специфический ДНК-зонд гибридизировался с большой полосой размером 5 т. п. о. в образцах poly-А-мРНК, выделенной из нормальных трабекулярных остеобластов человека.

Пример 12.

Эксперименты по in situ-гибридизации с использованием протокадгерин-специфических РНК-зондов осуществляли на замороженных срезах ткани крыс.

Смысловые и антисмысловые ³⁵S-рибозонды изготавливали с использованием стандартной методики, описанной Promega (Madison, Wisconsin ). В качестве рс42-специфического зонда использовали ScoRI-XbaI-фрагмент (приблизительно в 400 п. о.) кДНК-клона MOUSE-326. Этот фрагмент кодирует область, начинающуюся с середины субдомена EС-3 и простирающуюся до конца субдомена EС-4 рс42. В качестве рс43-специфического зонда использовали Smal-фрагмент (приблизительно 700 п. о.) кДНК-клона RАT-218. Этот фрагмент кодирует область, начинающуюся от конца субдомена EС-3 и простирующуюся до конца субдомена ЕС-5 рс43.

Ткани взрослых крыс собирали, и сразу заливали ОСТ-соединением ( Tissue-Tek ) в формах для замораживания, после чего быстро замораживали в бане с 95%-ным этанолом и сухим льдом. Замороженные блоки хранили при -80^oС вплоть до их разрезания. С использованием криостата (Reichert-Jung, Model 2800 Frigocut N, Leuca, Inc., Gilroy, California ) были получены 6-микронные срезы тканей. Срезы вырезанных тканей хранили при -80^oС.

Схема гибридизации in situ представляла, собой модификацию метода, описанного Angerer и др. ( Methods in Enzymology, 152: 649-660 (1987)). Все растворы были обработаны диэтилпирокарбонатом ( DЕРC, Sigma, St. Lous, Missourri) для удаления примесей РНКазы. Срезы тканей сначала подвергали фиксации в 4%-ном парафоряальдегиде при 4^oС в течение 20 минут. Для удаления избыточного параформальдегида и прекращения фиксации тканей, предметные стекла промывали в PBS (забуференном фосфатом физиологическом растворе), денатурированном в серийно разведенном спирте (70, 95, 100%), а затем осушали. Для предупреждения отслаивания ткани от предметного стекла во время in situ-процедуры срезы тканей обрабатывали 10 минут при комнатной температуре раствором поли-L-лизина ( Sigma ). Для денатурации всей РНК в ткани срезы помещали на 2 минуты (при 70^oС) в раствор 70% формамида/2х SSC (0,15 М NaCl/0,3 М Nа - цитрат, рН 7,0), после чего эти срезы промывали в охлажденном 2хSSC, дегидратированном в серийно разведенном спирте, а затем осушали. После осушки срезы подвергали предварительной гибридизации в гибридизационном буфере [ 50% формамид/50 мМ DTT (дитиотреитол)/0,3 М NaСl / 20 мМ Трис, рН 8.0/5 мМ EDTA/1 х раствор Денхардта (0,02% фиколл типа 400/0.02% поливинилпирролидон/0,02% BSA )/10% декстрансульфат] в течение примерно 4 часов при температуре конечной гибридизации. После предварительной гибридизации к каждому срезу добавляли приблизительно 1•10⁶ им./мин соответствующего рибозонда. Эти срезы обычно гибридизировали в течение ночи (12-16 часов) при 45^oС. Для гарантии специфичности реакции гибридизации, в некоторых экспериментах, жесткость гибридизации повышали путем увеличения температуры гибридизации до 50^oС. Поскольку эксперименты при температуре 45 и 50^oС давали сравнимые результата, то была использована стандартная температура гибридизации 45^oС.

Для удаления избыточного непрореагировавшего зонда срезы подвергали серии промывок. Сначала срезы промывали в 4 х SSC для удаления основной массы гибридизационного раствора и зонда. Последующую 15-минутную промывку в 4 х SSC /50 мМ DTT осущеcтвляли при комнатной температуре. Использовали также промывки в условиях повышенной жесткости. 40-минутную промывку в 50% формамиде/2 х SSC /50 мМ DTT осуществляли при 60^oС. Четыре конечные промывки при комнатной температуре проводили в течение 10 минут (каждую): две промывки в 2 х SSС и две промывки в 0,1 х SSC. Промытые предметные стекла дегидратировали в серийно разведенных растворах спирта, а затем осушали.

Для визуализации гибридизированного зонда, предметные стекла погружали в ядерную эмульсию NTB2 Kodak ( International Biotechnology, New Haven, Connecticut), которая была разведена в тяжелой воде (dH₂O) в отношении 1:1. После осушки предметные стекла хранили при 4^oС в светонепроницаемых коробках в течение соответствующего периода экспонирования. In situ - препараты были независимо исследованы двумя специалистами и оценены на положительный или отрицательный результат в отношении гибридизационного сигнала.

Все эксперименты по гибридизации in situ осуществляли на тканях крыс. Поскольку результаты, полученные из Нозерн-блот-экспериментов (см. пример 9), показали, что рс42 и рс43 экспрессируются в головном мозге взрослых особей, то с помощью гибридизации in situ были проведены исследования по определению локализации экспрессии этих молекул для специфических типов клеток головного мозга. Гибридизация, наблюдаемая в нормальном головном мозге взрослых крыс, была специфической (то есть с использованием смысловых зондов, фоновой гибридизации не наблюдалось), и локализовалась в специфических областях головного мозга. Общие картины экспрессии, наблюдаемой для рс42 и рс43, были очень схожи, однако, уровни экспрессии этих белков сильно отличались друг от друга. Оказалось, что рс43 экспрессируется на более низком уровне, чем рс42. Обе молекулы экспрессировались в эмбриональных и пирамидных клетках гиппокампа, в клетках Пуркинье мозжечка и в нейронах серого вещества. Кроме того, рс42 экспрессировался в глиальных клетках белого вещества головного мозга, но в противоположность экспрессии рс43 в клеточной линии глиомы (как описано в примере 9), в нормальных глиальных клетках экспрессии рс43 не наблюдалось. В спинной струне оба протокадгерина экспрессировались в мотонейронах серого вещества, а рс42 экспрессировался в глиальных клетках белого вещества.

При анализе экспрессии молекул протокадгерина в головном мозге и в спинных струнах крыс с ЕАЕ (экспериментальный аллергический энцафаломиелит) [Vanderbark et al. , Cell. Immunol.,12: 85-93 (I974)], была получена та же самая картина экспрессии, которая описана выше. Кроме того, экспрессия рс42 наблюдалась в лейкоцитарных инфильтратах в ЕAЕ-тканях. Экспрессия рс42 в лейкоцитах была подтверждена анализом путем гибридизации in situ с использованием двух клеточных линий лейкоцитов, RB1-1 и у3.

Экспрессию протокадгеринов-42 и 43 наблюдали в развивающемся головном мозге крысиных эмбрионов в течение всего периода эмбриологического тестирования (E15-E19). Кроме того, экспрессию протокадгерина-43 наблюдали в сердце развивающихся крыс в течение всего периода эмбриологического тестирования (E13-E19). Результаты этих исследований совпадали с результатами иммуногистохимического анализа, что свидетелъcтвует о том, что протокадгерин-43 экспрессируется в сердце взрослых особей.

Для определения возможной роли протокадгерина в развитии нервной системы были также исследованы профили экспрессии членов семейства протокадгеринов в головном мозге развивающихся крыс и в головном мозге взрослых крыс методом гибридизации in situ. Для этого серии венечных, сагиттальных и горизонтальных срезов головного мозга крыс, взяты в дни постнатального развития: 0, 6, 14, 30 (Р0-Р30) и через 3 месяца (молодая взрослая особь), гибридизировали с меченными кРНК-зондами, соответствующими различным протокадгеринам настоящего изобретения, включая рс42, рс43, RAT-212, RAT-411 и RAT-418. В развивающемся головном мозге RАТ-411 экспрессировался на высоких уровнях в нейронах обонятельной луковицы, то есть в митральных клетках и перигломерулярных клетках. Экспрессия мРНК RAT-411 была кратковременной, то есть, эта экспрессия появлялась в Р0 (в день 0 постнатального развития), достигала максимума в Р6, уменьшалась к P14, и не обнаруживалась в Р30 и в головном мозге взрослых особей. Было обнаружено, что у взрослых особей мРНК рс43 экспрессируется преимущественно в клетках Пуркинье мозжечка. Экспрессия мРНК рс43 в клетках Пуркинье наблюдалась с самого начала дифференцировки клеток Пуркинье примерно в день 6 постнатального развития (Р6). Другие члены семейства протокадгеринов экспрессировались на очень низких уровнях в различных областях развивающегося головного мозга и головного мозга взрослых особей. Эти результаты свидетельствуют о том, что члены семейства протокадгеринов имеют различные типы экспрессии в процессе развития центральной нервной системы, и дают основание предположить, что RАТ-411 и рс43 играют специфическую роль в процессе развития нейронов обонятельной луковицы, и клеток Пуркинье соответственно.

Пример 13.

Для идентификации протеинов, которые взаимодействуют с рс43 в L-клеточных трансфектантах осуществляли стандартную иммунопреципитацию c использованием поликлональных антител против рс43 и моноклонального антитела 3812C.

рс43- и химерные рс43-трансфектанты подвергали метаболическому мечению путем инкубирования клеток в модифицированной по методу Дульбекко среде Игла, содержащей ³⁵S]-метионин (50 мкКи/мл), в течение ночи. После промывания транcфектанты лизировали с использованием PBS, содержащего Тритон х 100, и инкубировали с антителом против рс43. Затем иммунокомплексы собирали с использованием гранул "белок А-сефароза". Полученные гранулы пять раз промывали буфером для промывки (50 мМ Трис-HCl, рH 8,0, содержащей 0,5 М NaCl, 0,1% овальбумин, 0,5% NP-40, 0,5% Тритон х 100, и 1 мМ EDTA) при комнатной температуре. Белок выделяли с помощью ДСН-электрофореза в ПААГ, и подвергали авторадиографии.

Химерный рс43 совместно осаждался с полосами 105 кДа и 95 кДа, которые, очевидно, соответствуют α- и β-катенинам соответственно поскольку антитела против α-катенина и против β-катенина окрашивали полосы сравнимых размеров. С другой стороны, рс43 совместно осаждался с полосой 120 кДа.

Хотя настоящее изобретение описано на примерах, с использованием конкретных методов и композиций, однако, необходимо иметь в виду, что в него могут быть внесены различные изменения и модификации, не выходящие за рамки существа и объема нижеследующей формулы изобретения.

Формула изобретения

1. Очищенная и выделенная полинуклеотидная последовательность, кодирующая протокадгерин рс3 человека и соответствующая аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 110.

2. Полинуклеотидная последовательность по п. 1, которая представляет собой ДНК-последовательность.

3. ДНК-последовательность по п. 2, которая представляет собой кДНК-последовательность.

4. Полинуклеотидная последовательность по п. 1, включающая последовательность SEQ ID NO: 109, кодирующую протокадгерин рс3 человека.

5. Полинуклеотидная последовательность по п. 2, предназначенная для трансформирования или трансфецирования штамма клеток-хозяев, таким образом, что указанный штамм способен экспрессировать полипептид протокадгерина.

6. Очищенная и выделенная полинуклеотидная последовательность, кодирующая протокадгерин рс4 человека и соответствующая аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NО: 115.

7. Полинуклеотидная последовательность по п. 6, которая представляет собой ДНК-последовательность.

8. ДНК-последовательность по п. 7, которая представляет собой кДНК-последовательность.

9. Полинуклеотидная последовательность по п. 6, включающая последовательность SEQ ID NO: 114, кодирующую протокадгерин рс4 человека.

10. Полинуклеотидная последовательность по п. 7, предназначенная для трансформирования или трасфецирования штамма клеток-хозяев, таким образом, что указанный штамм способен экспрессировать полипептид протокадгерина.

11. Очищенная и выделенная полинуклеотидная последовательность, кодирующая протокадгерин рс5 крысы и соответствующая аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NО: 112.

12. Полинуклеотидная последовательность по п. 11, которая представляет собой ДНК-последовательность.

13. ДНК-последовательность по п. 12, которая представляет собой кДНК-последовательность.

14. Полинуклеотидная последовательность по п. 11, включающая последовательность SEQ ID NO: 111, кодирующую протокадгерин рс5 крысы.

15. Полинуклеотидная последовательность по п. 12, предназначенная для трансформирования или трансфецирования штамма клеток-хозяев, таким образом, что указанный штамм способен экспрессировать полипептид протокадгерина.

16. Очищенный и выделенный полипептид протокадгерина рс3 человека, включающий аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 110.

17. Очищенный и выделенный полипептид протокадгерина рс4 человека, включающий аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 115.

18. Очищенный и выделенный полипептид протокадгерина рс5 крысы, включающий аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 112.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8, Рисунок 9, Рисунок 10, Рисунок 11, Рисунок 12, Рисунок 13, Рисунок 14, Рисунок 15, Рисунок 16, Рисунок 17, Рисунок 18, Рисунок 19, Рисунок 20, Рисунок 21, Рисунок 22, Рисунок 23, Рисунок 24, Рисунок 25, Рисунок 26, Рисунок 27, Рисунок 28, Рисунок 29, Рисунок 30, Рисунок 31, Рисунок 32, Рисунок 33, Рисунок 34, Рисунок 35, Рисунок 36, Рисунок 37, Рисунок 38, Рисунок 39, Рисунок 40, Рисунок 41, Рисунок 42, Рисунок 43, Рисунок 44, Рисунок 45, Рисунок 46, Рисунок 47, Рисунок 48, Рисунок 49, Рисунок 50, Рисунок 51, Рисунок 52, Рисунок 53, Рисунок 54, Рисунок 55, Рисунок 56, Рисунок 57, Рисунок 58, Рисунок 59, Рисунок 60, Рисунок 61, Рисунок 62, Рисунок 63, Рисунок 64, Рисунок 65, Рисунок 66, Рисунок 67, Рисунок 68, Рисунок 69, Рисунок 70, Рисунок 71, Рисунок 72, Рисунок 73, Рисунок 74, Рисунок 75, Рисунок 76, Рисунок 77, Рисунок 78, Рисунок 79, Рисунок 80, Рисунок 81, Рисунок 82, Рисунок 83, Рисунок 84, Рисунок 85, Рисунок 86, Рисунок 87, Рисунок 88, Рисунок 89, Рисунок 90, Рисунок 91, Рисунок 92, Рисунок 93, Рисунок 94, Рисунок 95, Рисунок 96, Рисунок 97, Рисунок 98, Рисунок 99, Рисунок 100, Рисунок 101, Рисунок 102, Рисунок 103, Рисунок 104, Рисунок 105, Рисунок 106