Способ определения токсичности веществ

 

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТОКСИЧНОСТИ ВЕЩЕСТВ, предусматривающиД воздействие исспедуемого вещества на тест-систему при их совместной инкубации , отличающийся тем, что, с цепью повышения чувствительности, а также ускорения способа, в качестве тестсистемы используют суспензию протопластов , полученных из культуры-Bac Bu9 5иЪ1лСдС1 168 в концентрации 2 10 3 10 в 1 МП суспензии, при этом исследуемое вещество вводят в суспензию протопластов в количестве, составляющем О,О5-О,25. от общего объема суспензии. (Л

„„SU„„1057532

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21 ) 3421 258/28-1 3 (22 ) 12.04.82 (46) 30.11.83. Бюп. N 44 (72) О. И. А стахова, Л. С. Наумов, М. Н. Григорьева, Л. Е. Давыдкина, Н. B.Òàðàñoâà и А.H. Божко (71) Всесоюзный научно-исспедоватепьс-. кий институт биопогического приборостроения (53) 576.095.1 (088.8) (5Ь) 1. Ames В. N., Lec F. 0., Ouroton W.Е. An 1птргочед bacterial testsyctem for the detect>on and с1аьь1fication of mutagens and carcinogens.Proc. Natl. Acad. Sci., 70, 1973, р. 782-786.

2. Liw О. Kwaschi roska К., an

improved agar plate method for чаpid assesment of chemiсаl inhibition

to microbia1 population.-.Bu1l. Environ. Contam. Tonicol., 1981, 26, и 2, р. 145-149.

З(51) С 12 N 1/00//С 12 4 1/00;

С 12 R 1/125 (54),(57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТОКЛИЧНОСТИ ВЕЩЕСТВ, предусматривающий воздействие исспедуемого вещества на тест-систему при их совместной инкубапии, о т п и ч а ю ш и и с я тем, что, с пепью повышения чувствитепьности, а также ускорения способа, в качестве тестсистемы испопы уют суспензию протоппаотов, попученных иэ купьтуры Bgej 38ue

5ubti tip 168 в кониентрадии 2 ° 1083 ° 10 в 1 мп суспензии, при етом исследуемое вещество вводят в суспензию протопнастов в копичестве, составпяющем 0,05-0,25 от общего объема с успензии.

1 10

Изобретение относится к микробиоло. гическим исследованиям, в частности к разработке способов тестирования токсических веществ (например, отходов микробиологической промышленности), которые предназначен л для опенки загрязненности окружающей срецы.

В связи с нарастающим загрязнением биосферы отходами промышленного цроиэвоцства, в частности микробиологической промышиенности, разработка способов тестирования вредных эффектов токсических веществ-загрязнителей биосферы выдвигается в число первоочередных задач по охране окружающей среды. Многообразие токсических веществ предъявляет особые требования к системам тестиро- вания: дешевизна, эффективность тестирования, высокая пропускная способность

Этими свойствами облацают микробные тес1системы.

Известен способ тестирования мута генных (токсических) веществ с помощью бактерий, несущих мутации по репарации.

Согласно данному способу в качестве „.

Р тест-системы используют киетки 6Q ftng- .МИО t)phj gyjON, в которые цля облегчения цоступа тестируемых веществ вводят мутации; повреждающие структуру клеточной оболочки (фд1, fo )), При этом тестируемое вещество наносят на диск иэ фильтровальной бумаги, который помещают на бактериальный газон. Через

24 ч инкубации при 37 С оценивают мутагенный(токсический) эффект тестируемого вещества по величине зоны гибели бактерий. Тест-система отличается повышенной чувствительностью благодаря мутациям, повреждающим клеточную оболочку fl) .

Однако способ характеризуется длитеиь постыл гестирования. Кроме того, микросомы экстрактов печени, используемых в тестах на баЗВОпЕ бо для метаболической активации агентов, в то же время

87832 2 чашках. Минимальная определяемая концентрация фенола в пробе составляет

200 мкг (2О гlи), длительность определения 24 ч l2).

К недостаткам способа относятся его длительность и низкая чувствительность.

Цель изобретения - повышение чувствительности, а также ускорение способа.

I0 Поставленная цепь достигается тем, что согласно способу опрецеления токсичности веществ, предусматривающему воздуействие исследуемого вещества на тест-систему при нх совместной инкуба..

15 ции, в качестве тес системы используют суспензию протопластов, полученных из куиьтурыбас Инъ биbbбе 168 в концентрации 2 ° 108 - 3 ° 10 в 1 мл суспензии, при этом исследуемое вещест20 во вводят в суспензию протопластов в количестве, составляющем 0,05-0,25 от общего объема суспензии.

Сущность способа заключается в следующем.

25 Суспэнзию протопластов получают известным методом из культуры ВаС

9ЦМ6 168 в логарифмической фазе роста на солевой среде с содержанием сахароэы 68,5 гlи и щелочным значениЗ0 ем рН среды. Количество протопиастов в 1 мл составляет 2 ° 108 - 3 ° 10

В . причем объем токсического вещества, вводимого в суспензию протопластов, должен составлять 0,05-0,25 от o6mего

35 обьема сусле изин, для того чтобы выживаемость протопиастов составляла 5060%, Минимальная вводимая доза токсиг ческого вещества находится в пределах

1-50 мг/л.

40 В качестве тестируемого вещества выбран цезоксон.

Зависимость токсического эффекта де,эоксона {5 мг/л) от концентрации протопластов приведена в табл. 1 .

Та б л и ца

Количество протопиастов в 1 мл суспензии, Т

50: 10

Оптическая плотность суспензия

Выживаемость протопластов, %

1,2

0,3

0,4

1,8

61

0,45

0,5

0,6

2,8

4,2

5,3

0,8 способствуют .их детоксикации, что затрудняет тестирование токсичности.

Наиболее бя зок к предлагаемому по технической сущности и достигаемому эффекту способ определения токсичности веществ, предусматривающий воздействие исследуемого вещества на тест-систему при их совместной ннкубации. Согласно известному способу смесь бактериальных культур, выращенную в течение 18 ч, высевают на чашки, затем вносят токсические агенты в градиентных концентрациях н через 18 ч ннкубации регистрируют зоны подавления роста культур на

1057532

Табиида 3

100

Контропь

100

10

50,Табпица 210

Таб пиаа 4

Доза, мг/и, вещества

10QO0: 2500

300 500

0,5

0,25

57

0,2

0,125

0,1

0,05

0,025

Таблица 5

М инимапьные концентрации токсических веществ, тестируемые на системе протопиастов Of., gubtj bg 168

Доза, мгl п, вещества

Лнзоц

Хпор- . Формапьамин дегна

Аммиак

Фенол

Напидиксовая

Мета-, amass

Дез1оксон к-та

2;5

10

50

Данные табп. 1 показывают, что дпя попучения 50-60% выживаемости прото« ппастов оптимаиьным ящияется их копичество 2 ° 108 - 3 -10 в 1 мп суспензии.

Зависимооть токсического эффекта от 5 допи токсического вещества (дезоксон

5 мгlи) в суспензии протоппастов- при-. ведена в табп. 2.

" Данные табп. 2 показывают, что дпя

50-60% выживаемости протоппастов "З0 оптимапьным явпяется такой объем токсического вещества, который составпяет

0,05-0,25 общего объема суспензии.

В табп. 3 приведена зависимость токсического эффекта от концентрации ток- д5 сичесхого вещества (метапикиина).

И

Сравнивая данные табл. 5 с данными табп. 4, можно сдепать вывод, что ис» попьзование протоппастов в качестве тест-системы на токсические вещества приводит к возрастанию чувствитеиьнос», ти тестирования на нескоиько aopaaaos, Пример 1. Протопласты 8ac..

gubgj Ejg 168 попучают по известному методу. В качестве попнопенной жидкой и твердой сред дпя выращивания штамма

Этаноц Хпорамин В Лизол Фенои

Как видно из табп. 3 минимацьная концентрация метапикпина, дающая 50% выживаемость, составпяет 50 мгlп.

Таким образом иссиедуют токсичес кий эффехт ряда токсических агентов.

Данные по минимапьным хонпентрапиям токсических веществ, тестируемых на протоппастах, представпеиы в табд, 4.

Как видно из табп.,4, с помощью протоппастов,Вас,бОйс ejS 168 можно тестировать копне нтрздии исследованных токсических агентов в предепах 150 мг/п.

Токсический эффект некоторых as этих агентов ранее бып иссцедован sa кпетках . Вас.Oubtjejs168 Данные по минимапьным концентрапням, тестируемым ha кпет,:ках &ос.doubt.itic 168 дредставпены в таби. 5.

50 испопьзуют мясо»пептониый агар (МПА) и мясо-пептонный бупьон (МПБ). Дия попуче пня и стабииизапии протоппастов испопьзуют гипертоническую среду Р со сиедуюшего состава, г/и: Kg НРО„3,5; кv,Po415; и н4с8 10 есе оо35;

Иаеб О,O58; NaqO< O,з; NgC0 т

-a5H+ 4,26; сахароза 68,5 (рН 7,6).

16-18 ч куиьтуру ВОС.suh4ejs 168, выращенную на чашках со средой МПА, 1057532

ВНИИПИ Заказ 9469/31 Тираж 523 Подписное

Фини ал ППП "Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 засевают в МПБ так, чтобы оптическая ппотность суспензии составпяпа 0,4-0,7 при цпине вопны 560 нм и дпине светового пути 1 см. Купьтуру выращивают до логарифмической фазы роста при 37еС 5 с аэрацией.

Бактерии осаждают центрифугированием при 4- тыс об/мин в течение 10 мин.

Кажцые 5 мп суспензии кпеток поспе осажцения центрифугированием ресуспенци ° 0 руют в 3 мп среды Р, вновь центрифу гируют (4 TbIc. Q6/Mèн, 10 мин) и ресус- . пендируют в 2 мп среды P. К попученной суспензии цобавпяют пизоцим так, чтобы концентрация пизоцима в суспенэии состав 5 пяла 300 мкг/яп.

Попученную смесь инкубируют при

37 С и мягком встряхивании в течение

30-40 мин.

Контропь за образованием протоппастов20 и подсчет протоппастов осуществпяют с помощью фазово-контрастного микроскопа МБИ-11. Инкубацию с пизоцимом прекращают в том спучае, еспи протоппасты. составпяют не менее 907 суспенэии.

Отмытые от пиэоцима протоппасты брабатывают цезоксоном при 37 С 30 мин при мягком встряхивании (объем токсиче-" ского вещества составпяет 0,1 от общего объема суспенэии). 30

Время опрецепения составпяет 5 ч, чувствительность 5 мг/п.

Пример 2. Протоппасты Вас, фд1 9 ц168 попучают по известному методу.

В качестве попноценной жидкой и твер дой срец дпя выращивания штамма испопьэуют МПА и МПБ. Дпя попучения и стабипиэации протоппастов испопьэуют ги- 4> пертоническую среду P спедукяпего соста« ва, r/ï: К НРО4 3,5; К Н2РО4 1,5; ц н4сР 1.0; кое 0,035; васе 0,058;

80 504 0,3; Мф С("GH О 4,26; сахароза 68,5 (pH 7,8).

16-18 ч купьтуру Вас,g0bti 4el68, выращенную на чашках со средой МПА, -засевают s МПБ так, чтобы оптическая ппотность суспенэии составпяпа 0,4-0,7 при.цпине вопны 560 нм и дпине светово го пути 1 см. Купьтуру выращивают до погарифмической фазы роста при 37 С

6 с аерапией.

Бактерии осаждают центрифугированием при 4 тыс об/мин в течение 10 мин. Каждые 5 мп суспензии кпеток поспе осаждения центрифугированием ресуспенцируют в

3 мп cpeg i Р, вновь центрифугируют (4 тыс. o6/мин, 10 мин) и ресуспендируют в 2 мп среды Р. К попученной суспендии цобавпяют 1 мп раствора пизоцюма так, чтобы конечная концентрация пизоцима в сусленэни составпяпа 300 мкг/мп. Попученную смесь инкубируют при 370С и мягком встряхивании в течение 30-40мин, Контроль за образованием протоппастов и подсчет протоппастов осуществляют с помощью фазово-контрастного микроскопа

МБИ-11. Инкубацию с пизоцимом прекращают в том случае, еспи протоппасты составпяют не менее 90% суспензии. Измеряют оптическую ппотность попученной суспензии протоппастов и разводят ее средой P так, чтобы оптическая ппотность составпяпа 0,4 — 0,5 единиц (h = 500 нм . спектрофотометр 5 ec t ГOinoe- 204" ), что соответствует 2 "10 — 3 - 10 протоппастов в 1 мп суспензии.

Попуче иную суспензию протоппастов разпивают в пробирки по 1 мл. К 1 мп суспенэии цротоппастов (тест-система) добавпяют исснедуемое вещество феноп в объеме 0,1 мп, и попученную смесь (анапизируемая проба) инкубируют при .37 С и мягком встряхивании 30 мин.

Одновременно в таких же условиях инкубируют смесь 1 мп протоппастов с

0,1 мп среды P (контропьная проба).

В контропьной и анапизируемой пробах подсчитывают копичество выживших протоппастов в камере Горяева при фазово-контрастной микроскопии. По данным подсчета протоппастов в камере Горяева опредепяют выживаемость протоппастов и степень токсического аффекта путем сравнения выживаемости в контропьной и анапиэируемой пробе (выживаемость протоппастов в контропьной пробе принимается эа 100%3.

Минимальная выявпяемая KoHHBHtpBUBH фенопа составпяет 1 мгlп.

Таким образом, прецпагаемый способ по сравнению с известным позволяет повысить чувствитепьность олрецепения до 1-50 мг/п и ускорить время проведения анапиза до 5-6 ч.