Питательная среда для получения сферопластов микобактерий туберкулеза

 

ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ СФЕРОПЛАСТОВ МИКОБАКТЕРИЙ ТУБЕРКУЛЕЗА, содержащая калий фосфорнокислый однозамешенный, натрий фосфорнокислый двуэамешенный, магний сернокислый, глицерин, сахарозу, лизоцим и дистиллированную воду, о т л и чающаяся тем, что, с целью ускорения получения сферопластов, она дополнительно содержит лаурилсульфат натрия при следующем количественном соотношении компонентов, мае. %: Калий фосфорнокислый, однозамещенныйО,1-О,15 Натрий фосфорнокислый двузамещенный0,15-0,17 Магний сернокислый0,05-0,075 Глицерин2,5-3,0 Сахароза15,О-2О,0 Лизоцчм0,8-1,0 i Лаурилсульфат натрияО,4-0,6 Дистиллированная вода Остальное (Л

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК

„.Я0„„1057533

3(51) С 12 К 1/20

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И OTHPblTHA

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

И ABTOPCHOMV СВИДЕТЕЛЬСТБУ (2 1 ) 3 281657/2 8-13 (22) 03.02.81 (46) 30.1 1 83, Бкп. % 44 (72) И,В.Коваленко (71) Белорусский научно-исследователь-, ский институт туберкулеза (53 ) 576,8.093. 1 (088.8 ) (56) 1, Millet H. The induction by

lysosime of an 1 -type growth in Micobacteria. Canad J. Microbiology, 1966, l2, р. ll — 16. (54)(57) ПИТАТЕЛЬНАЯ CPEglA ДЛЯ

ПОЛУЧЕНИЯ СФЕРОПЛАСТОВ МИКОБАК ГЕРИЙ ТУБЕРКУЛЕЗА, содержашая калий фосфорнокислый однозамешенный, натрий фосфорнокислый двуэамешенный, магний сернокислый, глицерин, сахарозу, лизоцим и дистиллированную воду, о т л и1 ч а ю ш а я с я тем, что, с целью ускорения получения сферопластов, она дополнительно содержит лаурилсульфат натрия при следуюшем количественном соотношении компонентов, мас, %:

Калий фосфорнокислый, однозамешенный 0,1-0,15

Натрий фосфорнокислый двуэамешенный 0,1 5-0,17

Магний сернокислый 0,05-0,07 5

Глицерин 2,5-3,0

Сахароза 1 5,0-20,0

Лизоццм 0,8-1,0

Лаурилсульфа т на трия . 0,4-0,6 йистиллированная вода Остальное

1057533

Иэобре тение относи тся к микробиологии, s частности к бактериологической диагностике, и касается питательной среды для получения сферопластов микобактерий туберкулеза. 5

Известна.питательная среда для получения сферопластов микобактерий ry6epzyaeaa, содержащая калий фосфорнокислый однозамещенный, натрий фосфорнокислый двузамешенный, магний сернокислый, гли- {О церин, сахарозу, лизоцим, цитрат аммония, аспарагин, бактоагар, бычий сывороточный альбумин, никотинамид, холестерол, ЭЙТВ и дистиллированную воду fig

Однако известная среда не обеспечи» {5 вает быстрого псщучения сферопластов, Ileab изобретения — ускорение получения сфер оппас тов.

П ос тввленная цель дос тигае тся тем, что в питательной среде для получения сферо- 20 пластов микобактерий туберкулеза, содер жащей калий фосфорнокислый одноэамешенный, натрий фосфорнокислый двузамешенный, магний сернокислый, глицерин, сахарозу, лизоцим и дистиллированную Воду, 0BG . 25 допопнительно содержит лаурилсульфат натрия при следующем количественном соотношении компонентов, вес. /о.

Калий фосфорнокислый одн оэвмеше нный 0,1-0,15

На трий фосфорнокислый двузвмеще нный 0,15-0,17

Магний сернокислый 0,05-0,075

Глицерин 2,5-3,0

Сахароза 1 5,0-20,0

Лизоцим 0,8-1,0

Лаурилсульфат натрия 0,4-0,6 дистиллированная вода Остальное

Среду готовят следующим образом.

Пример l. Соли, глицерин и саха40 розу беру в следующем порядке г в соотношении ингредиентов, вес. /о:

Калий фосфорнокиспый однозамешенный 0,125

На трий фосфорнокислый двуэамещенный 0,175

Магний сернокислый 0,65

Сахароза 17,5

Глицерин 2,75

Указанные ингредиенты растворяют в

2100 мл дистиллированной воды и стери50 лизуют в автоклаве при 0,5 втм в тече« ние 30 мин. После охлаждения раствора к нему добавляют, соблюдая стерильность, лиэоцим и лвурилсульфат натрия при следующем соотношении ингредиентов, вес. :

Лиэоцим 0,9

Лаурилсульфат натрия 0,5

Среда готова к применению.

Пример 2. Среду готовят при следующем соотношении ингредиентов, вес

Калий фосфорнокислый однозамеше нный 0,1

На трий фосфорнокислый двуэамешенный 0,15

Магний сернокислый 0,05

Глицерин 2,5

Сахароза 15,0

Лиэоцим 0,8

Лаурилсульфат натрия 0,4 .Дистиллированная вода Остальное

В приготовленную среду помещают микобактерии туберкулеза человеческого вида штамм Н { КЧ в концентрации 0,05 r сухого веса культуры на 1 мл среды (или 5 г на 100 мл среды). Среду с помещенным в нее штаммом инкубируют в термостате в течение 24 ч при 370С, после чего полученные сферопласты трижды отмывают путем цен трифугирования цри 3 тыс. об/мин, физиологическим раствором. При ýr0M общий Bb1xoA биомассы сферопластов составляет -!,5 r или 90 от исходного веса культуры. При весовом соотношении ингредиентов среды ниже приведенных в примере значений выход биомассы существенно снижается. Так, при весовом соотношении ингредиентов среды ниже приведенных в данном примере значений на 0,05-0,1 выход биомассы сферопластов с предлагаемой среды составляl ет 65-75 от исходного веса культуры.

Пример 3. Среду готовят при следующем соотношении ингредиентов, вес.о .

Калий фосфорнокислый однозамещенный 0,15

На трий фосфорнокислый двузамещенный 0,2

Магний сернокислый 0,075

Глицерин 3,0

Сахароза 20,0

Лизоцим 1,0

Лаурилсульфат натрия 0,6

Q»c тиллировв иная вода Ос таль н ое

В приготовленную среду помещают микобактерии туберкулеза человеческого вида штамм Н { RY в концентрации 5 г на

100 мл среды. Среду с помещенным в нее штаммом инкубируют в термостате в течение 24 ч при 37 С, после чего полученные сферопласты трижды отмывают путем центрифугирования при 3 тыс. o6/мин B физиологическом растворе. При этом общий выход биомассы сферопластов составляет

4,9 г или 97" or исходного веса культуКонтроль (среда с

0,01% и лизоцимв

0,2% ЭЙТА) (0,8% лизоцима) Лизис Лизис Лизис кле ток кле ток клеток

Лизис клеток

Лизис клеток

Q (0,8% лиэоцима

0,4% лвурилсульфвтв натрия) 60-80% частичный лиэис кле70 96,8

45-50

Й

0,1% лизоцимв и0,6% лвурилсульфата натрия) 70% час тичный лизйс кле80 82,5

2 5-30 40-60 7 5-80

QY (12,0% лизицима и 0,6% лаурилсульфата натрияя) Лизис Лизис Лизис клеток клеток клеток

1 5-20 Лизис Лизис клеток клеток

ВНИИПИ Заказ 9469/3 Тираж 523 Поцписное

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4

3 1057 533 4 ры. Максимальные весовые значения ингре- цима и 0,4% лаурилсульфата натрия, в диентов, приведенные в данном примере, которой процент сферопластообразования являются оптимальными, при которых на за 24 ч инкубации составил 96,8%. Лиэо реде наблюдается лизис сферопластов. цимы 1 и ХХ вызывают лизис клеток.

Контроль эа сферопластообрвэованием 5 Использование питательной среды позпроводят методом фаэовоконтрастной и воляет ускорить получение сферопластов электронной микроскопии, Среды имеют микобактерий туберкулеза (24 ч вместо следуюшие характеристики.сферопласто 7-14 сут), удешевить среду, исключить образования (см. табл). длительный процесс пассирования, что, в

Как видно.из таблицы, наиболее эффек- свою очередь, позволяет снизить расход

1D тнвной оказалась среца 9 с 0,8% лизо- питательных сред.

Сферопластообразование на испытуемых средах