Способ определения эстеразной активности в биологическом материале

 

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ЭСТЕРАЗЫ В БИОЛОП1ЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ путем физико-химического анализа пробы, о т л. и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью определения активности эстеразы в замороженном биологическом материале, в него перед замораживанием бводят флуоресцеиндипропионач в конечной концентрации и по .нарастанию интенсивности флуоресценции образующегося флуоресцеина определяют активность эстеразы. §

СОКИ СОВЕТСНИХ

С»»»Л% О 4» РЕСПУБЛИН (1а (11}

1(51} 0 01 N 33/48 (ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ABTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 3377602/28-13 (22 ) 05.01. 82 (46) Х5 01 84. Бюл. 9 2 (72) В.И. Луговой, А ° М. Грек, В.A. Коптелов и Л.A. Ханина (71) Институт проблем криобиологии и криомедицины AH УССР (53) 577 .15.08(088.8) (56) 1. Дузу П. Криобиохийия, М., "Мир", 1980, с.3-5.

2. Fennema О. Activity of enzymes

in Partially frozen agueous systems. . Water Relat. Foods, Proc. Symp.

Glasgow, (огdon е.а., 1975, р. 397413 (прототип). (54) (57) СПОСОБ ОПРЕ(ВСЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ЭСТЕРАЗЫ В БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ путем физико-химического анализа пробы, о т л. и ч а ю ц и й.с я тем, что, с целью определения активности эстеразы в замороженном биологическом материале, s него пе» ред замораживанием вводят флуоресцеиндипропионам в конечной концентрации 10 - 10 М и по нарастанию интенсивности флуоресценции обраэунхцегося флуоресцеина определяют активность эстеразы.

Ф 1 0674

Изобретение относится к физичес- .кой химии и криобиохимии и может найти применение при иэучении процессов замооаживанип - оттаивания, а также пои консервировании сыворотки и клеток крови, органов и тканей и B пищевой промышленности.

Известен спектрофотометрический способ определения активности ряда ферментов в переохлажденных растворах, заключающийся в том, что реакцию проводят в переохлажденной среде,.1 содержащей органические растворители (этиленгликоль, метанол, пропиленгликоль, ДИСО и другие ), точка замерзайия которой ниже 0 С f 1 3.

Однако этот способ не позволяет 15 определить активность ферментов непосредственно в замороженном состоянии.

Известен также способ определения активности инвертазы при замораживании биологического объекта с различной скоростью и до различных температур, при котором замороженный биологический материал оттаивают и затем колориметрически опре-. . 25 деляют активность инвертаэы (2 j.

Этот способ также не позволяет определять зктивность фермента непосредственно в замороженном биологическом материале.

Целью изобретения является определение активности зстеразы в замороженном биологическом материале.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу определения активности эстераэы в биологичемком материале путем физико-химического анализа пробы, в него перед .замораживанием вводят флуоресцеин дипройионат в конечной концентрации

10 -10 M и по нарастанию интенсив- 40 ности флуоресценции образующегося флуоресцеина определяют активность эстеразы.

Способ осуществляют следующим образом. 45

В биологический материал (сус- пензия клеток, гомогенат клеток, суспензия лиэосом ) вводят нефлуоресцирующее соединение - флуоресцеинди- пропионат - в конечной концентрации

10 - 10 М, пробы сразу замораживают.и определяют интенсивность флуоресценции образующегося флуоресцеииа при длине волны возбуждения

Ъ =486+1 нм и максимуме длины волны флуоресценции Ъф — †517 нм. Ин55 тенсивность флуоресценции находится в прямой зависимости от количества флуоресцеина, являющегося продуктом эстеразной реакции„

П р.и м е,р 1. К 3,0 мл дистилли- hO рованной воды добавляют 20 мкл сусПензии лнзосом (40 мг белка/мл1), выделенных из изолированных клеток печени крыс. В разведенную суспензию лиэосом добавляют флуоресцеинди- 65

+20

+20

+20

%-2 0

16

-10

30

60

-10

90

-10

120

-10

Пример 2. Проводят аналогично примеру 1, но при конечной концентрации флуоресцеиндипропионата 10 M.

Полученные данные приведены в табл ° 2. ю

Таблица2

-10

40

42 пропионат в конечной концентрации

10 М и сразу же замораживают в парах жйдкого азота до "10 С. После этого измеряют интенсивность флуорееценции флуоресцеина при длине волны возбуждения Аэ = 486 нм и максимуме длины волны флуоресценции h ф = 517 нм. Величина интенсивности флуоресценции служит в качестве контроля эстераэной реакции. Через

30 мин хранения при -10ОC определяют интенсивность флуоресценции при длине волны возбуждения ) 8 = .486 нм и максимуме длины волны флуоресценции

) = 517 нм. Эту операцию повторяют через 30 мин в течение последующих

1,5 ч хранения при -10ОC. В случае осуществления эстеразной реакции при комнатной температуре (+20. C) по такой же схеме ойа полностью завершается через 10 мин инкубации.

Максимальный уровень флуоресценции одинаков в обоих случаях.

Полученные данные приведены в табл. 1.

Т а б л и ц а 1

1067442

Предлагаемы способ позволяет по возрастанию интенсивности флуореСценции Флуоресцеина, образующегося в результате жстераэной реакции, судить о ходе и скорости эстераэной

5 реакции в замороженном биологическом материале от 0 С до темнератур эвтектики.

Продолжение табл. 2

-10

46

-10

90 с

120

-10

Составитель Н. хрусталева

Техред С. Мигунова Корректор В. Вутяга

Редактор М. Петрова т

Филиал ППП "Патент", r. ужгород, ул. Йроектная, 4

Эакаэ 11203/49 Тираж 828 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5