Способ получения @ 4- @ или @ прегненолона

 

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИЛИ Н ПРЕГНЕНОЛОНА из 4- . н холестерина с помощью реконструированной холестерингидроксилирующей системы, содержащей иммобилизованный на сефарозе адренодоксин, сорбированные на адренодоксин-сефароэе препараты адренодоксинредуктаэы и .холестеринспецифичного цитохрома Р-450, и .ОРН-генерирующей системы, включающей NADPH, глюкозо-6-фосфат к глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта , используют глюкозр-6-фосфатдегидрогенаэу , иммобилизованную на сефарозе.§ 2.Способ по п. 1, о т л и ч ающ и и с я тем, что NADPH используют СЛ в концентрациях О, 25 10 -5 10 М. JJ,,,, 3.Способ по п. 1, о т л и ч а ю- СИ щ и и с я тем, что глюкозо-бфосфат используют в концентрациях 10 -lOTd.S SW QD О -sl а:

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИН (19) (11) 3(51) С 12 P 35 00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3446747/28-13 (22) 02.06.82 (46) 07.05.84. Бюл. Р 17 (72) Б. Г. Радюк, В,М. Шкуматов, В.Л. Чащин и, А.A.вихрем (71) Институт биоорганической химии

AH CCP (53) 547.92 (088.8) (56) 1. Bryson М, J. Sweat М.Ь.

Cleavage of cholestегоl side chain

associated with cytochrome P-450, fiavoprotein, an non heme ironprotein derived from bovine adrenal cortex, J.Biol. Chem. 1968, v; 243,Ь 10, р. 2799-2804, 2. Ахрем А.A., Шкуматов Б.М., Чащин В.Л. Структурная организация митохондриальных стероидгидроксилирующих комплексов. Биоорганическая химия, 1978, т. 4, М 5, с. 688693.

3. Akhrem А.А. Larco V.N. Larco AЛ. Shkumatov V.Ì., Chashchin Ч.Ь, Isolation, structural organization

and mechanism of action of mitochon-

drial stегоid hydroxylating systems.

-Acta biol. meH.germ.1979, v. 38, Р 2 3, р. 257-273, 4. Axen R., Porath T. Ernback S.

Chemical coupling of peptides and

proteins to polysaccharides by means

of cyanogen halides. — "Nature", 1967, 9 214, р, 130 2-1304.

5, Nakajin S., Ishii Y., Shinoda М., Shikita M., Binding of triton Х-100

to purified cytochrome P-450 scc

and enchancement of the cholestегоl

side-chain cleavage activity.-Biochem, Biophys. Res.Communs, 1979, v. 87, 9 22, р. 524-831. (54) (57) 1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ 14- C)

ИЛИ (H) ПРЕГНЕНОЛОНА из (4- С) (Н) холестерина с помощью реконструированной холестерингидроксилирую- . щей системы, содержащей иммобилизованный на сефарозе адренодоксин, сорбированные на адренодоксин-сефароэе йрепараты адренодоксинредуктазы и .холестеринспецифичного цитохрома

P-450, и NADPH-генерирующей системы, включающей NADPH, глюкозо-б-фосфат и глюкозо-б-фосфатдегидрогеназу, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта, используют глюкозо-б-фосфатдегидрогеназу, иммобилизованную на сефарозе. 9

О

2. Способ по и. 1, от лич аюшийся тем, что NADPH используют в концентрациях 0,25 10 -5 ° 10 4 М.

3. Способ по п. 1, о тлич аюшийся тем, что глюкозо-б-.фосфаты используют в концентрациях 10 -10 Ъ1.»

1090716

Изобретение относится к биохимии, конкретно к усовершенствованному способу получения радиоактинно меченого прегненолона иэ радиоактйвио меченого холестерина, и может найти! применение для ферментатинного сии= теза радиоактивно меченых стероид-: ных гормонов, необходимых при соэ" дании медицинских радиодиагности.ческих наборов стероидного профиля, а также для исследовательских целей в химии, биологии и эндокринологии.

Ферментативная трансформация холестерина в прегненолон, являющийся предшественником всех кортикостероидных гормонов, осуществляется в митохондриях клеток коры надпочечни.ков млекопитающих многокомпонентной ферментной системой, включающей

NADPH-специфичный фланопротеид "(адренодоксинредукт азу), негемовый же-. леэосеросодержащий белок (адренодоксин) и холестеринспецифичный цито— хром Р-450 (11 .

Химический аналог этой реакции (две реакции гидроксилирования. молекулы холестерина при С-20 и С-22 и окислительное расщепление боковой цепи 20,22-диоксихолестерина) также, как и микробиологическая трансформация холестерина в прегненолон, отсутствуют .

Химические способы получения 4- С) или (>H) прегненолона в литературе не описаны.

Известен способ получения (4- С) 4 или3 Hj прегненолона из (4- Cj или (H) холестерина при помощи реконструированной холестерингидроксилирующей системы, содержащей иммобили-, зо в анный н а се фар оз е белок — адр енодоксин, сорбированные на адренодоксинсефароэе препараты белков — адрено доксинредукт азы и холестерин специфичного цитохрома Р-450 и NADPH-генерирующей системы, включающей NADPH, глюкоэо-6-фосфат и глюкозо-6-фосфатдегидрогенаэу. Радиактивный прегненолон получают пропусканием раствора субстрата через колонку с указанной ферментативной системой (2j.

Недостатком данного способа является низкий выход радиоактивно мече- ного прегненолона, составляющий 1525%, что позволяет получить лишь микрограммэвые количества прегненолона, Цель изобретения - повышение выхода целеного- продукта, Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения (4- С) или РН) прегненолона из 4-" С) или pH) холестерина с помощью реконструированной холестерингидроксилирующей системы, содержащей иммобилизованный на сефарозе адренодоксин, сорбированные,на адренодоксин-сефароэе препараты адренодоксий5

t5

65,редуктазы и холестеринспецифичного цитохрома р-450, и NADPH-генерирующей системы, включающей ЫАЭРН, глюкозо-б-фосфат и глюкоэо-б-фосфатдегидрогеназу, используют глюкоэо-6фосфатдегидрогеназу„ иммобилизованную на сефарозе.

Причем NADPH используют в концентрациях 0,25 ° 10 -5 10 М, При этом глюкозо-б-фосфат используют в концентрациях 10 — 10 N.

В результате способ обеспечивает повышение выхода целе во го продукта до 804.

На чертеже графически изображена превращение холестерина в прегнанолон при пропускании через колонки.

Колонки содержат реконструированную ковалентно-сорбционным способом холестерингидроксилирующую систему и коналентно иммобилизованную глюкозо-б-фосфатдегидрогенаэу растворов субстрата с различными концентра циями NADPH и глюкозо-б-фосфат. Кривая 1-5 10 М NADPH и 10 М глюкозоб-фосфат; кривая 2 — 10 М NADPH u

10 М глюкозо-б-фосфат; кривая 3

0,25 10 М NADPH и 10 М глюкоэо-бфосфат. Концентрации холестерина и добавляемого в среду тнина 20 во всех случаях составляют 0,25 1.0 М

-4 и 2 10 М соответственно.

Пример . Для ковалентно-сорбционной реконструкции холестерингидроксклирующей системы используют гомогенные белковые компоненты этой системы — адренодоксинредуктазу, адренодоксин и цитохром Р-450, выделенные из митохондрий коры надпочечников крупного рогатого ската (31.

Ковалентную иммобилиэацию адренодоксина осуществляют путем сочетания белка с CNBr-активированной сефарозой по общепринятой методике (4).

Аналогичным образом проводят иммобилиз ацию глюкозо-б-фос фатдегидроген азы,. Концентрации иммобилизованных адренодоксина и дегидрогеназы составляют 350-400 нмоль и 1,6-2 мг на

1 мл уплотненного геля, соответственно. Удельная активность иммобилизованной глюкозо-б-фосфатдегидрогеназы, определяемая из начальной скорости образования NADPH, составляет

14 международных единиц на 1 мг иммобилизованного фермента.

К 10 мл 0,05 М натрий-фосфатного буфера рН 7,2 (буфер А) добавляют

О, 5 мл уплотненного геля адренодоксин-сефарозы, содержащего 200 нмоль иммобилизованного адренодоксина, K полученной суспенэии при непрерывном перемешинании добавляют 2 мл эквимольной смеси (по 25 нмоль каждого белка) препаратов адренодоксинредуктазы и цитохрома Р-450, диализованных против буфера А. Смесь перемешивают в течение часа при комнат1090716 ной температуре, после чего несорбированные на адренодоксин-сефарозе белки отделяют центрифугированием при 300д х 10 мин. Для полного отделения несорбированных белков гель дважды промывают 10-ти мл порциями буфера A с последующим центрифугированием при 3000д х 10 мин. Степень сорбции адренодоксинредуктазы и цитохрома Р-450, определяемая по убыли содержания этих белков в водной фазе, составляет 90-95%, Осажденный гель с реконструированной ковалентно-сорбционным способом холестерингидроксилирующей системой

cycпендируют в 5 мл буфера А и до- 15 бавляют к полученной суспенизии пор+ цию ковалентно иммобилизованной глюКо3о-6-фосфатдегидрогеназы, содержащую 5 единиц фермента. Приготовленной таким. образом смесью заполняют 70 колонку с диаметром 1 см и уравновешивают 50 мп буфера А с твином 20 в концентрации 200 мкМ (0,03% объем/ . объем). Раствор холестерина готовят на 200 мл буфера А, содержащего

200 мкМ твин 20, конечная концентрация стерина составляет 25 мкМ. К раствору субстрата добавляют (H) или (4- С) холестерин из расчета, чтобы удельная радиоактивность суммарного стероида составляла не менее 200000 имп,мин нмоль ) . К раствору субстрата добавляют далее NADPH и глюкозо-б-фосфат до необходимых конечных концентраций. Полученный раствор пропускают при комнатной температуре через колонку с иммобилизованными белками со скоростью 8 мл/ч.

Элюат собирают по фракциям 8 мл с помощью коллектора фракций. Для анализа превращения холестерина в прегне40 нолон во времени используют 1 мл порции каждой фракции . Стероиды из этих порций экстрагируют 4 мя этилацетата, упаривают досуха, остаток растворяют в этилацетате и подверга- 45 ют разделению тонкослойной хроматографией на пластинках с закрепленным слоем силикагеля в системе гексан диэтиловый эфир — уксусная кислота (15:15:1). После проявления хромато- 50 грамм парами иода пятна, соответствующие по хроматографической подвижности прегненолону и холестерину, удаляют с пластин и определяют радиоактивность с помощью жидкостного сцинти" 5 ляционного счетчика. Степень трансформации холестерина в прегненолон рассчитывают ло формуле A 100% /А +

В + В; где A — радиоактивность в пятне прегненолона;  — радиоактивность @ в пятне холестерина;  — радиоактивность всего силикагеля от старта пластинки до фронта растворителя, за исключением пятен, соответствующих холестерину и прегненолону. Для каж- 65 дого опыта используют количество смеси сор бенто в, сост ве ствующе е О, 7 ю уплотненного геля и содержащее 5 ед. глюкозо-б-фосфатдегидрогеназы, 200 нмоль адренодоксина и по 22 нмоль цитохрома Р-450 и адренодоксинредуктазы. Образующийся прегненолон очищают с помощью тонкослойной хроматографии и идентифицируют на основании сравнения хроматографических подвижностей со стандартом прегненолона в различных системах растворителей., Ðàäèîхимическая частота полученного продукта составляет не менее 95%. Из . чертежа видно, что во всех случаях степень трансформации выходила на .максимум; составляющий 50-80%, через ,2-6 ч проведения реакции. Общей закономерностью для кривых 1-3 является снижение уровня образования прегненолона после выхода активности колонок по трансформации холестерина на максимум, Сравнение кривых 1 и 2 показывает, что уменьшение концентрации

NADPH в 5 раз приводит к умень ению степени трансформации в максимуме (60%), но менее резкому, чем для кривой 1 падению активности колонки.

Из сравнения кривых 1-3 видно, что уменьшение концентрации NADPH и глюКо3о-6-фосфата в 20 и 10 раз соответственно сопровождается некоторым снижением степени" трансформации в максимуме (50%), при аналогичном ходе инактивации, как и для кривой 2. В таблице приведены суммарные выходы прегненолона, рассчитанные из кривых

1-3.

Из представленных в таблице данных следует, что использование аналитических вариантов колонок с иммобилизованными холестерингидрокси лирующей системой и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназой позволяет получать в отличие от известного способа миллиграммовые количества радиоактивно меченного прегненолона (выход до 80%), При этом значительно сокращается расход дорогостоящих NADPH, глюкозо-6фосфата и глюкозо-б-фосфатдегидрогеназы . Введение в буфер для приготовления субстрата 200 мкМ твина

20 сопровождается повышением растворимости холестерина более чем на порядок, кроме того, этот детергент по вышает активность холестерингидроксилазы в растворе 5) . Использование иммобилизованной глюкозо-6-фасфатдегидро ген азы сопровождается э ффективной регенерацией кофактора в объеме колонки, в результате чего исключается возможность локального накопления окисленного кофактора как ингибитора реакции . В различных вари антах опытов, указанных в таблице, используют 5 ед, иммобилизованной глюкозо-6-фосфатдегидрогенаэы. Ана-. логичные опыты с применением раство1090716

Условия . . Суммарный молярный Суммарный выход

° выход прегненолона прегненолона, мг мкмоль

1. НАОРН 5 ° 10 Й глюкозо-6-Фосфат

1Р 2М

0,426

1, 346

2. NADPH 10 Мр глюкоза-6-фосфат

1Р 2М

1, 476

0,467

3 NADPH 0,25 10 М, глюкозо-6-Фосфат

10 М

1,248

О, 395

Трансфоркацил(эИ) "лолгсщерина Яз f J-лврегненолон,%

1И

Прегненвлон, ЯНОЛЬ/НЯ

8f очаг дл 60 нл

ВНКИПИ Заказ 3015/23 Тирам 522 Подписное мв ю «в

Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул.Проектная, 4 римой дегидрогеназы требуют, как мини. мум,концентрации Фермента 0,5 ед. в 1 мп, т.е. в каждом опыте по 80 ед, Таким образом, предлагаемый способ позволяет добиться 20-ти кратного снижения расхода NADPH u 10-ти кратного - глюкоэо-6-Фосфата без за метного изменения суммарного выхода прегненолона (таблица, условия 1 и 3) .

Проточные реакторы с иммобилизованной холестерингидроксилирующей 10 системой можно испольэовать многократно. Проведение 5 циклов трансформаций продолжительностью по 4 ч (с трехсуточными интервалами между нные) .с использованием одной колонки характеризуется следующими величинами степени трансформации холестерина в прегненолонг

1 цикл 50%; 2 цикл 36%1 3 цикл 30%; 4 цикл 25%| 5 цикл

21% .