Способ получения 7 (д-5-амино-5-карбоксивалерамидо (-3-) - метокси-псульфооксициннамоилоксиметил)7-метокси-3-цефем-4- карбоновой кислоты и 7 -(д-5-амино-5карбоксивалерамидо (-3-) метокси-п-оксициннамоилоксиметил) -7-метокси-3-цефем-4- карбоновой кислоты

 

О П И С А Н И Е ии 518142 изоыиткн ия

Союз Советских

Социалистических

Республик

К ПАТЕНТУ (61) Дополнительный к патенту (22) Заявлено 12.03.71 (21) 1631862/1830318/13 (51) М. Кл. - С 12D 9/14 (32) Приоритет 13.03.70 (31) 19496 (33) США

Опубликовано 15.06,76. Бюллетень № 22

Государственный комитет

Совета Министров СССР (53) УДК 615.779 931 (088.8) оо делам изобретений н открытий

Дата опубликования описания 08.>9.76 (72) Авторы изобретения

Иностранцы

Эдвард Оллей Старлей (США) и Хусто Мартинез Мата (Испания) Иностранная фирма

«Мерк энд Компани, ИНК>» (США) (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ 7 Р-(Р-5-АМИНО-5КАР БО КС И ВАЛ ЕРАМ И ДО)-3-(n-МЕТО КС И-иСУЛЬФООКСИ ЦИННАМОИЛОКСИМЕТИЛ)-7-МЕТОКСИ-3ЦЕФЕМ-4-КАРБОНОВОЙ КИСЛОТЫ И 7+(Р-5-АМИНО-5КАРБОКСИВАЛЕРАМИДО)-3-(сс-МЕТОКСИ-и-ОКСИЦИ Н НАМО ИЛОКСИМЕТ ИЛ)-7-МЕТОКСИ-3-ЦЕФЕМ-4-КАРБО НО ВОЙ

КИСЛОТЫ

Изобретение относится к производству антибиотиков.

Предлагаемый способ получения 7 P-(D-5амино-5-карбоксивалерамидо) -3- (к - метоксии- сульфооксициннамоилоксиметил) -7-метоксн3-цефем-4-карбоновой кислоты и 7р- (D-5-амино-5-карбоксивалерамидо)-3-(u - метокси- иоксициннамоилоксиметил) - 7-метокси - 3-цефем-4-карбоновой кислоты, ранее в патентной литературе не описанный, заключается в том, что культуру — продуцент из группы акти номицетов, например

Streptomyces griseus МА-2837, выращивают в аэробных условиях иа среде, содержащей источннкн углерода, азота и минеральные соли, с последующим выделением целевого продукта из фильтра культуральной жидкости из вестными приемами, причем выращивание осуществляют на среде, содержащей 1 — 6% углерода и 0,2 — 6,0% ассимилируемого азота при температуре 20 — 37 С и рН 5,5 — 8,0.

Штамм Streptomyces griseus МА-2837, продуцируемый предложенный антибиотик имеет следующие особенности на следующих питательных средах.

Томатная паста с агар-овсяной мукой. Обратная сторона колонии коричневая. Воздушный мицелий в центре рыжевато-коричневый до серовато-желтого, край рыжевато--коричнево-желтый. Растворимый пигмент — рыже10 вато-коричневый.

Глицерин-аспарагиновый агар.

Субстрактный мицелий рыжевато-коричневый. Воздушный мицелий порошкообразный, рыжевато-коричнево-желтый. Растворимый

15 пигмент светлый рыжевато-коричнево-желтый, Агар Чапек-Докса. Субстрактный мицелий желтовато-оранжевый. Воздушный мицелий порои|кообразный, рыжевато-коричнево-жел20 тый (несколько оттенков, но преимущественно край — рыжевато-желтый), рост слабый в центре и сильнее по краям. Растворимый пигмент светлый, рыжевато-желтый.

Агар из яичного белка. Субстрактный мице.тий серовато-рыжевато-коричневый. Воздушный мицелий рыжевато-коричнево-желтый с зеленоватым оттенком, край коричнево-рыжевато-желтый, рост слабый в центре и сильнее по краям. Растворимый пигмент светлый рыжевато-желтый.

5Келатиновый косой агар.

Рос в виде осадка на дне сосуда, слоистый, окрашенный в кремовый цвет.

Питательный желатиновый агар вегетативный мицелий кремовый. Воздушный мицелий бледный, рыжевато-желтый. Растворимого пигмента нет, сжижение желатина хорошее.

Лакмусовое молоко, Неполное кольцо. Вегетативный мицелий коричневатый. Воздушный мицелий мягкий, беловатый.

Снятое молоко. Неполное кольцо. Вегетатнвный мицелий коричневый, Воздушного мицелия нет. Растворимый пигмент светло-коричневый.

Крахмальный агаровый косяк. Вегетативным мицелий кремовый. Воздушный мицелий палевый. Растворимого пигмента нет. Хороший гидролиз.

Картофельная масса. Вегетативный мицелий светло-желтый.

Воздушный мицелий средний, Слабое потемнение картофеля.

Агар яблочно-кислого кальция.

Вегетативный мицелий плоский полупрозрачный и бесцветный по краям темный и кремово-окрашенный в центре. Воздушный мицелий от кремового до желтого. Края рыжеватожелтые. Растворимого пигмента нет.

Тирозиновый агаровый косяк.

Вегетативный мицелий кремовый.

Воздушный мицелий желтовато-рыжий с зеленоватым оттенком, края рыжевато-желтые. Растворимый пигмент очень светло-коричневый.

Агар пептонно-железо-дрожжевого экстракта.

Вегетативный мицелий кремовый. Воздушного мицелия нет. Растворимого пигмента нет. Сероводород не образует. Хорошо усваивает глюкозу, арабинозу, ксилозу, мальтозу, маннозу, маннит, лактозу; плохо усваивает: мнозит, сахарозу, рамнозу, рафинозу; не усваивает: фруктозу и целлюлозу.

Кроме вышеуказанной культуры (МА-2837), были идентифицированы дополнительно двадцать пять культур как продуценты антибиотика. Они включают: три культуры вида

Streptomyces griseus, одиннадцать культур

Streptomyces viridochromogenes, пять культур

Steptomyces fimbriatus, три культуры Яг.

halstedii, одну культуру Streptomyces rochei, одну культуру Streptomyces cinnamaneusis и одну культуру Streptomyces chartreneusis. Эти штампы рода Streptomyces идентифицируются как культуры МА-4160, МА-4174, МА-4171, МА-4177, МА-4178, МА — 180, МА518142

3959

3961

55

4164,МА-4165, МА-4166, МА-4167, МА-2892, МЛ-3265, МА-4162, МА-4163, МА-4159, МА4169, МА-4170, MA-4179, МА-4161, МА-4168, МА-4175, MA-4181, МА-2938, MA-4176 и МА4173 F) коллекции культур фирмы Ме ск и Со., Juc. Ка!гьау Нью-Джерси. Эти культуры помещены на постоянное хранение с коллекцией культур Northeru Utilization Research and

Development Brauch of the U. S.äåïàðòàìåíòà сельского хозяйства США в Peoria, Иллинойс.

Культурам .присвоены следующие номера

Streptomyces griseus

МЛ-4160 1 1КК1 3951

МА-4174 NRRL 3953

MA-4171 NRRL 3952

Streptomyces viridochromogenes

МЛ-4177 МКК1 3970

MA-4178 NRRL 3971

МА-4180 NRRL 3972

20 MA-4164 NRRL 3966

МЛ-4165 NRRL 3967

МЛ-4166 URRL 3968

МА-4167 NRRL 3969

МЛ-2892 NRRL 3962

25 МА-3265 NRRL 3963

МА-4162 NÊÊ1 3964

МЛ-4163 ХКК1 3965

Streptomyces fimbr а1цз

MA-4159 ХКК1 3954

МА-4169 NRRL 3956

МА-4170 NRRL 3957

МА-4179 ЮККЕР 3958

МА-4161 ХКК1 3955

Sireptomi ces halstedii

З5 МА-4168 ККК1

МА-4175 NRRL

МА-4181 NRRL

Streptomyces rochei

МА-2938 МККК 3973

40 Streptomyces cinnamoneusis

МЛ-4176 МКК1 3974

Streptomyces chartreusis

МА-4173 UR К1 3975

Пример 1.

45 Культуру Яг. griseus выращивают на среде, имеющей следующий состав:

Среда 1:

Difco дрожжевой экстракт 10,0 г

Глюкоза 10,0 г

Фосфатный буффср 2,0 мл

M gSO4 7 Н20 0,05 г

Дистиллированная вода 1000,0 мл

Difco агар 25,0 г

* Фосфатный буффер:

КН2РО4 91,0 r

Na2HP0 95,0 r

Дистиллированная

60 вода 1000,0 мл

Косой агар готовят путем разливания среды по 4 мл в пробирки. Пробирки затем закрывают ватными пробками и стерилизуют при температуре 120 С в течение 15 мин, так что сре05 да застывает в наклонном положении. Иноку5)8142 лированпый скошенный агар выдерживают при 28 С в течение одной недели и затем хранят при температуре 4 С до использования.

Культуру на одном из этих агаров используют для инокуляции в колбах Эрленмейера (250 мл), содержащих 50 мл среды II. В пробирки добавляют 5 мл стерильной среды, соскабливают с поверхности агара культуру и осторожно прикапывают по 1 мл культуры в каждую из трех колб.

Среда Il имеет следующий состав, г:

Мясной экстракт 3,0

NZ амин (ферментативный гидролизат казеина) 10,0

Декстроза 10,0

Na Сl 5,0

Дистиллированная вода 1000,0 рН нейтрализуется до 7,2 с помощью NaOH

Засеянные пробирки встряхивают с помощью ротационной качалки со скоростью

220 об/мин в течение трех дней. Затем пробирки с культурой используют для инокуляции в колбах Эрленмейера емкостью 2 л, каждая для которых содержит 350 мл среды Ш, причем используется 2 — 3%-ная культура.

Среда Ш имеет следующий состав, г:

Декстроза 10,0

Аспарагин 1,0

К2НРО4 0,1

XgSO,.7Н,О 0,5

Дрожжевой экстракт 0,5

Индикатор элементов смеси М 2 10,0 мл

Дистиллированная вода 1000,0 мл

Состав индикатора элементов смеси Мю 2:

FeSO4 7Н30 1,0 г

Мп 504 Н20 1,0 г

ÑuÑl3 2Н20 25,0 мг

С аС13 100,0 мг

НЗВ 3 560 мг (NH4) 3Моу034 4Н30 19,0 мг

ZnSO4 ° 7Н30 200,0 мг

Дистиллированная вода 1000,0 мг рН доводят до 7,2 с помощью раствора NaOH

Пробирки встряхивают с помощью качалки со скоростью 135 — 150 об/мин в течение

4 дней при температуре 28 С. В конце инкубационного периода содержимое одиннадцати прооирок сливают и исследуют. Смешанный, полученный в результате центрифугирования бульон, имеет защитную зону против Proteus

Vulgaris, равную 22 мл при исследовании на чашках Петри с дисками. Эта смесь антибиотика включает 7р-D-5-амина-5-карбоксивалерамидо-) -3- (u - метокси - n - сульфооксициннамоилоксиметил) - 7-метокси-3-цефем-4-карбоновую кислоту и 7р-(D-5-амино-5-карбоксивалсрамидо-) -3- (а-метокси — n - оксициннамоплоксиметил) -7-метокси-3-цефем — 4-карбоновую кислоту (1 а).

Этап 1.

Содержимое лиофилизированного туба (MA-2837) суспендируют в 2 мл среды I/см., пример, 1), и образующийся инокулум лиофилизированной культурой МА-2857 ипокулируют скошенный агар среды М 1 (см. пример 1).

Эти скосы инкубируют при 28 С в течение 5 дней или до образования спор, а затем 10 мл среды VIII добавляют к скосам.

Среда Vl! I, состав, /о, Мясной экстракт 0,3

NaCl 0,5

NZ Амин 1,0

Декстроза 1„0 рн 7,0

Культуру на каждом агаре соскабливают и полученную суспензию используют в качестве инокулама на этапе 2.

Этап 2.

Суспензию, полученную на этапе 1, используют для инокулирования колбы Эрленмейера, в которой содержится 50 мл стерилизованной среды VIII (см. этап 1). Инокулированную колбу помещают на 48 ч при 28 С вроторную качалку (220 об/мин).

Этап 3.

Содержимое инокулированной колбы из этапа 2 используют для инокулирования двухлитровой колбы Эрленмейера, содержащей

500 мл среды VIII (см. этап 1). Инокулированную колбу помещают на 48 ч при 28 С в роторную качалку (220 об/мин).

Этап 4.

Полученный на этапе 3 инокулум используÇ5 ют для инокулирования ферментатора из нержавеющей стали емкостью 757 л, в котором находится 467 л стерильной среды Ч!!!. Ферментация проводится при температуре 28 С при перемешивании (130 об/мин) в течение 65 ч при

40 одновременной продувке воздуха, Во время ферментации используют в небольшом количестве пеногаситель-полигликоль 200.

Этап 5.

378 л полученного на этапе 4 инокулума используют для инокулировапия 4542 л среды

IX, находящейся в ферментаторе из нержавеющей стали емкостью 5680 л.

Среда IX, состав, /о..

Жидкость для замачивания

50 зерна 4,0

Декстроз а 2,0 рН доводят до 7,2 с помощью NaOH

Ферментацию проводят при температуре

55 28 С и перемешивании (1200 об/мин), пропуская через аппарат воздух в течение 30 — 36 ч.

В качестве пеногасящего агента используют небольшие количества полигликоля 200.

Бульон собирают и определяют его актив60 ность с помощью дисков чашек Петри, получают защитную зону против Proteus vulgaris

МВ-838. равную 32,5 мм при возрасте культуры в 31 ч.

Выделение антибиотика.

65 Отфильтрованную культурную жидкость

518142

7,23 кг ций по 18,9 л. 60 (40688 л), полученную на стадии А этап 5, собирают после 36 ч и рН доводят 7 — 8 до 3,0 в ферментаторе путем добавления фосфорной кислоты. При пропус кании культуральной жидкости через фильтр-пресс пластинчатого типа удаляют мицелий. Отфильтрованный бульон затем пропускают через фильтрующий слой адсорбирующей смолы (Амберлит ХАД2) объемом 378,5 л со скоростью 37,85 л/мин.

Отработанный бульон подвергают исследованию и сбрасывают, а фильтрующий слой смолы промывают двумя объемами воды. Антибиотик вымытывают из фильтрующего слоя смолы с помощью 60 -ного раствора метанола в воде, расход раствора равен 19 л/мин. Сорок фракций, каждая по 19 л, собирают и исследуют.

Фракции 2 — 10 объединяют и удаляют метанол путем вакуумного упаривания. рН конечного концентрата (157 л) доводят до 3,5 добавлением гидроокиси аммония и держат в охлажденном виде.

Образцы подвергают биоиспытаниям против Proteus vulgaris обычным методом с использованием дисковых чашек Петри. Отработанный бульон и промывка:

10 фракций по 378,5 л показали отсутствие защитных зон без разбавления, так же, как ч промывочная вода.

Общий вес твердого исследованного про1укта:

Отфильтрованный бульон 119 кг

738 л объединенного элюата

157 л .концентрированного элюата 7,2 кг

Полученный концентрат (78,5л) разбавляют

aoäîé до 117 л и адсорбируют на фильтрующем слое объемом 22,5 л, состоящем из слабоосновной анионообменной смолы. (Амберлит 1РА-68 смола на хлоридном кольце) при рН 4 и расходе равном 2 галлона/мин. Затем фильтрующий слой промывают 45 л промывочной воды, а затем элюируют раствором

1 М нитрата натрия и 0,,1 М ацетата натрия при рН 7,5 и расходе равном 1,5 л/мин. Собирают 10 фракций элюата по 18,9 л и доводят рН до 4 с,помощью соляной кислоты.

Все фракции подвергают биоиспытаниям стандартным методом с помощью дисков чашек Петри против Proteus vulgaris, Полученные фракции 1 — 10 объединяют и адсорбируют на адсорбирующей смоле Ам берл ит

ХАД-2, образующей фильтрующий слой объемом 45 л (при рН 3 и расходе 5 л/мин). Фильтрующий слой промывают 90 л воды с тем же расходом. Антибиотик затем элюируется из смолы 25О/о-ным водным раствором ацето»а при расходе 5 л/мин. Собирают 16 фракВсе фракции подвергаются биоиспытаниям обычным методом против Proteus vulgaris.

Прц исследован ни питательного раствора (190 л).

Фракции элюата 2 — 16 объединяют и в вакууме. выпаривают ацетон, получая в конечном итоге 17,4 л концентрата, затем с помощью гидроокиси аммония рН концентрата доводят до 4 и при последующей сушке замораживанием получают 620 г антибиотика 810А,.представляющего собой смесь, состоящую из 7Р(D-5-амино-5-карбоксивалерамидо) -3- (а - метокси-и - сульфооксициннамоилоксиметил) - 7метокси-3-цефем-4-карбоновой кислоты и 7Р(D-5-амино-5-карбоксивалерамидо) -3 - (а-метокси-n - окснциннамоилоксиметил) -7 — метокси-3-цефем-4-карбоповой кислоты. Полученный сухой продукт при концентрации 300 мкг/ мл дает 25 мм на защитную зону, Хроматографнчсскую колонку заполняют фильтрующим слоем высотой 100 см, состоящим из аниопообменной смолы ДЕАЕ Сефадеко А-25. Антибиотик 810А (10 г) растворяют в 18 мл раствора, состоящего из 0 5 молей бромистого аммония и 0,05 молей уксусной кислоты и заполняют этой смесью колонку.

Затем через фильтрующий слой прокачивают элюирующий раствор с расходом 81 ммолей/ч и отбирают фракции элюата по 10 мл. Элюат исследуют с помощью дифференциального рефрактометра, который зарегестрировал пики массы в трубках 19, 36, 79, 109 и 206. Каждую третью фракцию исследуют против Proteus

vulgaris (МВ-838) с использованием 0,5-дюймовых дисков при рН 7.

Проводят повторное исследование и фракции 82 †1 и 180 †2 объединяют.

Фракции, содержащие первый активный компонент из двух вышеприведенных опытов объединяют и адсорбируют на фильтрующем слое 100 мл смолы Амберлит ХАД-2, Фильтрующий слой промывают одним объемом воды и элюируют затем тремя объемами 90 ного водного раствора метанола. Метанол упаривают в вакууме и водный концентрат подвергают сушке замораживанием, получая

810 мг продукта, представляющего из себя

7Р-D-5-амино-5-кар боксивалерамидо) - 3- (аметокси-и - оксициннамоилоксиметил)-7 - метоксн-3-цефем-4-карбоповую кислоту. Биологическая активность этого продукта, определенная с помощью дисков против Proteus

vulgaris при концентрации 18 мкг/мл составила 25 мм (диаметр защитной зоны). Анализ на ультрафиолетовое поглощение дал следующие результаты:

УФ-поглощение в 0,1 í. HCI Хмакс 305

Е, " ",„524

УФ-поглощение в 0,1 í, NaOH XMa c. 328

E, "",„564

Фракции, полученные в двух сериях опытов на Сефадекс-А-25, содержащие второй активный компонент, объединяют и,адсорбируют на

100 мл фильтрующего слоя смолы Амберлит

ХЛД-2. Фильтрующий слой промывают одним объемом воды и затем элюаты объединяют, а метанол отгоняют, упаривая его в вакууме.

Водный концентрат высушивают заморажива"518142

Формула изобретения

Составитель С. 11 енева

Корректор О. Тюрина

Техред 3. Тараненко

Редактор Л. Емельянова

Заказ 2273, 3 Изд. № 1403 Тираж 575 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, 5К-35, Раушская наб., д. 4 5

Типография, пр. Сапунова, 2 нием и получают 720 мг7-P-(D-5-амино-5-карбоксивалерамидо) -3- (а - метокси-и-сульфооксицинпамоилоксиметил) -7 - метокси-3-цефем4-карбоновой кислоты (1 с). Анализ на ультрафиолетовое поглощение дал следующие результаты:

УФ-поглошение в 0,1 н. НС1 Хманс 287 мм

Е,", „432

УФ-поглощение в 0,1 и. Na0H аймаке 280 мм

Е," „432

1. Способ получения 7+ (D-5-амино-5-карбоксивалерамидо-) -3 (n-метокси-и - сульфооксициннамоилоксиметил) -7 - метокси-3 - цефем4-карбоновой кислоты и 7P- (D-5-амина-5-карбоксивалерамидо)-3-(я-метоксп - а - оксицинIlH моилоксиметил) -7-метокси-3 - цефем-4-карбоновой кислоты, отл и ч а ю щи и с я тем, ;го культуру-продуцент из группы актино5 мицетов, например Streptomyces griseus МА2837, выращивают в аэробных условиях на среде, содержащей исгочники углерода, азота и минеральные соли, с последующим выделением целевого продукта .из фильтрата куль10 туральной жидкости известными приемами.

2. Способ по п. 1, отлич ающийся тем, что выращивание осуществляют на среде, содержащей 1 — 6% углевода и 0,2 — 6 0% ассимилируемого азота, 15 3. Способ по пп. 1 — 2, отличающийся тем, что выращивание осуществляют при 20—

37 С и рН 5,5 — 8,0.