"Яманути фармасьатикал Ко., Лт ".,.":,..,, -..--,,;- (Япония) (72) Авторы изобретения (7!) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ 7-(5-АИИНО-5"ÊÀÐÁÎÊÑÈÂÀËEÐÀÈÈÄ0)-7-ИЕТОКСИ-3-(1-ИЕТИЛ-1Н-ТЕТРАЗОЛ-5-ИЛ)ТИОИЕТИЛ- -ЦЕФЕИ-4-КАРБОНОВОЙ КИСЛОТЫ ИЛИ EE СОЛЕЙ CO

ЩЕЛОЧНЫИИ ИЕТАЛЛАИИ

oAr

НООС- CH-(OH } -СОМЫ М вЂ” N гь

11 1! > 2 CH2- $ Т 3

С00М СИ, Изобретение относится к способу получения новых антибиотиков цефало споринового ряда, а именно 7-(5-анино-5-карбоксивалерамидо)-7-метоксигде И - атом водорода или щелочного металла, которые могут найти применение в медицине в качестве антибактериаль-. ных средств.

Известен способ получения антибиотиков цефалосйоринового ряда, в частности 7-(5-амино-5-карбоксивалерамидо)-7-метокси -3-карбамоилоксиметил-М -цефем-4-карбоновой кислоты, заключающийся в культивировании микроорганизма типа Streptomyces в культуральной среде, содержащей пита-:

- 3- (1-метил-1Н-тетра зол-5-ил) -тиоме-, тил-В -цефем-4-карбоновой кислоты или ее солей со щелочными металлами формулы тельные вещества. Для получения других 3-производных образующийся про дукт далее подвергают соответстую15 щим превращениям. Так, например, для получения 7-(5-амина-5-карбоксивалерамидо)-7-метокси-3-(1 3,4-тиадиазол-2-ил)-тиометил-6У-цефем-4-карбоновой кислоты. образующееся

20 3-карбамоилоксиметилпроизводное подвергают взаимодейс-вию с 1,3,4-тиадиазол-2-илтиолом, а затем целе-. вой продукт выделяют в виде свобод" ной кислоты или соли со щелочным

25 металлом E11..

90453

Цель изобретения - получение новых антибиотиков цефалоспоринового ряда, расширяющих арсенал средств воздействия на живой организм.

Эта цель достигается способом

5 получения соединений формулы I, который заключается в том, что культивируют продуцирующий 7-метоксицефалоспориновый антибиотик микроорганизм, принадлежащий к виду Strepto- 10 п1усез, в культуральной среде, содержащей питательные вещества, с добавлением 1-метил- 1Н-тетразол-5-илтиола . формулы

20 или его соли, или его дисульфидного соединения формулы

H2N

ЮН (СН2) -d0

Н 001 .

40 другой ациальной группой, например сС-аминофенилацетильной группой,ивЂ

-карбоксифенилацетильной группой, о(;сульфофенилацетильной группой,o(вЂ”

-оксифенилацетильной группой, пиридилтиоацетильнЬЙ группой, тиадиазолилтиоацетильной группой, триазолилацетильной группой, цианметилтиоацетильной группой, трифторметилтиоацетильной группой и т,.п., таким образом предлагаемое соединение так° же пригодно как промежуточное соединение для получения этих производных с этими ацильными группами, например, 7 (-цианметилтиоацетамидо-7

Таким образом целевое соединение с 1-метил-IН-тетразол-5-илтиометильной группой в положении 2 цефалоспо30 рина можно получить непосредственно за одну стадию ферментации.

Соединение 1 обладает высоким .противомикробным действием, Противомикробный спектр соединений можно расширить или изменить, заменив боковую

35 цепь - ацигльную группу в 7-ом положении формулы

3 ф

-метокси-3-(1-метил-тетразол-5-ил)-тиометил-Ь -цефем-4-карбоновая кись лота и 7зЬ-метокси-3-(1- метиптетразол-5-илтиометил)-715-(-трифторметилтиоацетамидо)-й -цефем-4-карбоновая з кислота.

Примером микроорганизмов, полезных при получении 7-метоксицефапоспориновых антибиотиков, относящихся к Streptomyces, может служить новый штамм Streptomyces 0ganonens s

Ч-G 19 Z, ранее выделенный из почвы в Огано-Тауне, Химибугун (профектура Саитама, Япония), Этот штамм сдан на хранение в институт микробиологи,ческой промышленности, агенство промышленных наук и технологии Иинистерства международной торговли Японии под! ГЕКИ-Р 2725,а также в американскую коллекцию типовых культур, 12301 Парклоун Драйв Гоквилл, Иериленд 20852, США, под номером АТСС

31167.

Ниже приведены микологические свойства этого штамма.

1. Иорфологические характеристики штамма S. 0ganonensis V-G 19 Z

Он растет как в природной, так и в искусственной среде с образованием хорошо разветвленного субстратного мицеллия, в то время как образование воздушного мицелия недостаточно и поэтому образование спор плохое. Цепи спор прямые, относятся к типу

R(Rectus) или RF (Rectif Iexi bi les), в каждой цепи по 10-50 спор. Споры элиптические, сферические или цилиндрические по форме, размер

0,45 " 0,60 х 0,55 вЂ” 0,90 мк. Поверхность спор гладкая. Не наблюдаются флагеллатные и спорангиевые споры.

2„ Культуральные характеристики штамма S Oganonensis V-G 19 Z приведены в табл.1 °

3. физиологические свойства штамма S oganonensis y-G 19 Z

Образование тирозиназы Отрицательное

Восстановление нитрата Положительное

Коагуляция Положительная, сливок слабая

Пептонизация Положительная, сливок слабая

Гидролиз крахмала Положительный

Ожижение Положительное, желатина слабое

904533

Разложение целлюлозы Отрицательное

Гемолиз Положительный

Солюбилизация малеата кальция Положительная

Утилизация углеродных соединений S. oganonensis Y-G 19 Z.

Источник уклерода

Утилизация

Глюкоза +

Арабиноза +

Сахароза

Ксилоза

Инозитол

Ианитол +

Фруктоза +

Рамноза

Рафиноэа

Характерные особенности штамма

Streptomyces ооапопепз1s V-G 19 2 следующие: относится к нехромогенному штамму Streptomvces; воздушный мицелий прямой без мутовки (типа R или RF); споры сферические или элиптические, споровая поверхность гладкая; дает светло-желто-серую до светло-желто-коричневой культуры на различных средах, цвет воздушного мицелия коричнево-белый, желто-белый и желто-серый, продуцируется антибиотик Ч-G 19 Z"ÄÇ, относящийся к 7-мегоксицефалоспориновой группе, При изучении известных штаммов с такими свойствами наиболее близким является Streptomyces globisporus

Однако, при сравнении с S.globisporus штамм V-G 19 Z отличается от него по следуащмм пунктам, показанным в табл.2.

Из данных таблицы видно, что пред" лагаемый штамм является новым штаммом, отличающимся от известного.

Как и 5treptomyces oganonens s, относящиеся к роду Streptomyces, нижеследующие штаммы продуцируют 7-метоксицефалоспориновые антибиотики:

Streptomyces griseus, Streptomyces se

viridochromogenes, Streptomyces fimbriatus, Streptomyces halstedii, Streptomyces rochei, Streptomyces

cinnamonensis, Streptomyces lactamdurans, Streptomyces lipmanii, .Strep-ss

tomyces clavuligerus, Streptomyces

wadayamensis, Streptomyces jumonjinensis, Streptomyces he tегоmorphus, Streptomyces panayensis u Strepto- .

myces chartreusis.

Однако предлагаемые штаммы не ограничены выше указанными штаммами, можно применять и любые штаммы, относящиеся к роду Streptomyces и продуцирующие 7-метоксицефалоспориновые. антибиотики.

1-метил-1Н-тетразол-5-илтиол (il) можно применять в аиде его неорганических солей, таких как соли щелочных металлов, щелочноземельных металлов, аммониевые соли и т.п., и солей органических оснований, таких как соли триэтиламина, триэтаноламина, дициклогексиламина, лизина, аргнина,.гистидина, основные водорастворимые антибиотики, например, канаминин, алкалоид, основной про" теин и т,п. Соли, имеющие высокую растворимость в воде, могут использоваться выборочно.

Кроме того, может быть использовано дисульфидное соединение 1-метил-1Н-тетразол-5-илтиола (I1!).

Культивирование ведут по обычным методам для всех микроорганизмов, но лучше вести погружное культивирование в жидкой культуре. Иожно приме" нять любую культуральную среду, содержащую питательные вещества для продуцирующих 7-метоксицефалоспориновые антибиотики штаммов, относящихся к роду Streptomyces. S качестве источника углерода в ней можно использовать глюкозу, сахарозу, маннитол, глицерин, декстрин, крахмал, растительные масла и т.п., в качестве источника азота - мясной экстракт, цептон, глютеновую муку, муку из хлопковых семян, соевую муку, ара" хисовую муку, рыбную муку, кукурузную муку, сухие дрожжи, дрожжевой экстракт, сульфат аммония, нитрат аммония, мочевину и другие органические и неорганические источники азота. В культуральную среду можно также добавлять при необходимости металлические соли, например сульфаты, митраты, хлориды, карбонаты, фосфаты и т.п., Na, К, Ио, Са, Zn и Ге, а также вещества, облегчающие образование антибиотиков, или,противовспенивающие агенты, например метионин, цистеин, цистин, метылолеат, лярд, силиконоваое масло, поверхностно"активные вещества и т.п.

1-Иетил-1Н-тетразол-5-ил-тиол (II) или его соль, или его дисульфидное соединение (tt) обычно добавляют в концентрации 0,1-5 мг/мл (лучше 0,5-2 мг/мл тиола). В культуральную среду их можно добавлять один раз перед культивированием или порциями в начальной стадии культивирования.

Желательно вести культивирова- 10 ние в аэробных условиях при температуре культивирования t8-35 С (лучше 30 С). Кроме того, желаемые результаты получают при рН культуральной среды 5-10 (лучше 6-8).

Длительность культивирования зависит от состава и температуры применяемой культуральной среды, но обычно она составляет от 3 до 10 дней; таким образом целевое вещество íà- zo капливается в среде по окончании культивирования.

Целевое вещество (i) можно выделить из .бульона обычным способом, применяемым для выделения антибиоти-25 ков из мицелия культивирующего бульона: целевой антибиотик содержится, в основном, в культуральном бульоне, следовательно после отделения мицелия центрифугированием или 30 фильтрованием целевое веществЬ извлекают из фильтрата. Таким образом, целевое вещество отделяют, выделяют и очищают обычными способами, характерными в производстве антибиотиков, например, используя разность в растворимости в соответствующем растворителе, разность сорбционного средства к различным сорбентам или разность в распределении между дву- <0 мя жидкостями. Эти способы можно применять раздельно или в соответствующеи их комбинации, или повторно.

9045 IS

2 3

Целевое соединение 1

Цефалоспорин С

7-метоксицефалоспорин С

Цефамицин С

Y.-G 19 Z-Д3

Y-G 19 Z-Д2

0,39 0,34 0,31

0,37 0,36 0,3-1

0,41

0 37

0,26

0 39

0э36 0 32

0,36 0,31

0,26 0,22

0,32 0,26 е е следующем отношении по объему

Изопропа,ол:бутанол: уксусная кислота: вода

21:3:7:9 физические и химические свойства

45 целевого соединения характеризуются следующими показателями: белый порошок, разлагается и обесцвечивается при 160- 170 С; легко растворимо в воде, ограниченно в метаноле и пло50 хо в других органических растворителях; амфотерное вещество с положительной ингидриновой реакцией, Уф-спектр поглощения при определении в фосфатном буферном растворе 0 0 1 M при рН 6,4, максимум по5S глощения при 273 ммк, ИК-спектр при определении в виде бромида калия поглощение при 3413, 2920, 1765, 1620, 1515 и 1390 см, ЯМР-спектр, определенный в TMS в качестве наружного стандарта и тяжелой воде дает следующие сигналы: величина Е (ч./млн); 2,36 (4Н, мультиплет), 2,96 (2Н, мультиплет), 3,98 (3Н,син" глет}4,38 (1Н, мультиплет), 4,50 (3Н, синглет), 5,59 (1Н, синглет); элементный анализ целевого вещества в наиболее чистом виде: С 37,4,и

4,25, и 16,47, S 10,904; при гидролизе 6 н ° соляной кислотой дает оС-аминоадипиновую кислоту; дает, 5-меркапто- 1-метил-1Н-тетразол при гидролизе в метаноле Довексом 50Ж (тип Н, торговое наименование).

Из этих данных видно, что соединение представляет собой 7-метоксицефалоспориновое соединение, поскольку оно дает сигналы при 3,98 ч./млн (3Н, синглет, 7-ОСН ) и 5,59 ч./млн (1Н, синглет, 6- СН) в ЯИР-спектре, поглощение в ИК-спектре при 1765 см (циклический лактам) и дает оС-аминоадипиновую кислоту при кислом гидролизе, кроме того, поглощение идет при 4,50 ч./млн (3Н, синглет, тетразол-й-метил) в ЯИР-спектре; при мягком гидролизе получают 5-меркапто-t-метил- 1Н-тетразол. Это соединение имеет указанную выше струк-, туру с гетероциклическим тиолом.

Результаты различных хроматографических анализов и бумажного электрофореза для целевого соединения приводятся ниже., Предлагаемая величина

Rf этого соединения в тонкослойной хроматографии с помощью микрокристаллической целлюлозы (авицел SF торговое наименование).

1 904533 l0 растворителей - ацетонитрил:0,1 4-ный раствор уксусной кислоты (рН 3,3) в отношении 1:9 по объему; скорость подачи - 0,8 мл/мин; скорость пода5 чи бумаги записывающего прибора "

1,0 см/мин. Бутанол:уксусная кислота:вода 4:1:2

Бутанол:уксусная кислота:вода 6:1,5:2,5 контрольный образец - цефамицин

С представляет собой 7-(5-карбоксивалерамидо)-3-карбамоилоксиметил-7-метокси-р -цефем-4-карбоновую кис.лоту.

V"G 19 Z-Д3 и 9-G 19 Z-Д2, применяющиеся в сравнительных опытах, являются новыми 7-метоксицефалоспориновыми соединениями, ранее выделенными из культуральной жидкости Streptomyces oganonensis.

Ниже приведена величина Rf, полученная бумажной разделительной хроматографией с помощью Фильтровальной бумаги Ватман h 1 и смесью раствори-. телей бутанол-уксусная кислота-вода, 2о в отношении 4:1:2 по объему.

Величина

3,4 см

3,5 см

6, l см

6,) см

Целевое соединение 0 39

Цефалоспорин С 0 36 25

7-метоксицефалоспорин С 0,40

Цефамицин С 0,35 G 19 Z-Д3 0,24

Y-С 19 Z-Д2 0,25 зо

Затем соединение подвергают анализу с помощью прибора высокоскоростной жидкостной хроматографии Хитачи (Hitachi) 635 и получают следующие результаты: колонка - 3к500 мм из нержавеющей стали; смола Хитачи ?610 (катионно-обменная смола, торговое наименование); система растворителей0,2 И цитратный буферный раствор (рН = 3,6); скорость подачи - 0,5мл/мин;о скорость подачи бумаги записывающего прибора 1,0 см/мин.

Время задержки

В табл.3 приводится противомикроб" ное действие предлагаемого соединения вместе с цефалоспорином С для сравнет ния.

Метод инфузионного агарового диска (раствор 500 6 /мл).

Численные величины указывают диаметр (мм) зоны ингибирования. предлагаемое соединение можно вво" дить в различных лекарственных формах как таковые или в комбинациях с другими лекарствами. Его можно вводить перорально, внутримышечно, внут" ривенно и т.п. в виде капсул, табле" ток, порошков, гранул, растворов и суспензий. Для получения препаратов можно применять различные добавки, например манитол, сахарозу, глюкозу, стерилизованную дистиллированную воду, изотонический раствор, растительное масло, например арахисовое масло, сезамовое масло. Кроме того, можно добавлять и другие ингредиенты например стабилизаторы, связующие, противоокислители, консервирующие вещества, лубриканты для таблеток, сус" пендирующие вещества, вещества, при5 дающие вязкость, отдуаки и т.п.

В качестве солей соединения применяют соли неорганических или органических оснований, которые фарма6 мин 00 с 4>

Колонка вЂ” p, Бондапак С, (фирмы нВальтерс Лтд") 4л300 мм; система

Целевое соединение

Цефалоспорин С 5 мин 18 с

7-метоксицефалоспорин С 5 мин 09 с

Цефамицин С 5 мин 18 с

Y-С 19 Z-Д3 3 мин 42 с

У-ь l9 Z""Д2 3 мин 42 с

Результат анализа на вышеуказан,ном приборе при следующих условиях приведен ниже.

Время задержки, Целевое соединение 1 мин 52 с

Результат полученный высоковольтным бумажным электрофорезом, следующий: Фильтровальная бумага Ватман

N 1; растворитель - l04-ная уксусная кислота (рН = 2,2), напряжение

42 В/см; длительность - 1 ч.

Длина передвижения

Целевое соединение 3,3 см

Цефалоспорин С 3 5 см

7-метоксицеФалоспорин С

Цефамицин С

У-G 19 Z""ÉÇ

Y-C l9 Z-Д2

Цистеиновая кислота 7,5 см

Глутатион 1,2 см

904533 12 кологически не являются токсичными.

Доза медикамента зависит, главным образом, от состояния больного и веса больного, а также от способа введения, т.е. перорального или парентерального способа. Как правило, вводят за один раз 50 мг/кг по нессколько раз в день.

Пример 1. Получение 7-(5амино-5-карбоксивалерамидо) 3 (1

-метил-1Н-тетразол-5-ил)-тиометил-7з

-метокси-Л -цефем-4-карбоновой кислоты.

Культуральную среду, содержащую

13 крахмала, 1i глюкозы, 1,5i соевой муки, 0,54 дрожжевого экстракта, 0,14 кислого. фосфата калия, 0,051 сульфата магния и 0,34 хлорида натрия, помещают в колбы Сакакучи по

100 мл в каждую и стерилизуют при

120 С в течение 20 мин. Затем каждую колбу инокулируют штаммом Streptomyces oganonensis V-C I9 Z и культивируют 48 ч при 30 С. Кроме того, вышеуказанную культуру помещают в колбы Сакагучи на 2 л по 400 мл в каждую и после стерилизации при

20"С в течение 20 мин каждую колбу инокулируют до 2-31 бульона, полученного выше, после чего ведут культивирование течение 24 ч при 0 С для образования инокулума.

60 л культуральной среды, содержащей 7i крахмала, 23 глютеновой муки, Zi соевой муки, 0,83 глицерина, 0,13 кислоты Казамино, 0,0Iip сульфата железа и 55 г едкого натра помещают в два ферментатора на

100 л вместе с 10 мл Адеканола (торговое наименование) в качестве противовспенивателя и после стерилизации в течение 30 мин при 120 С в каждый ферментатор вносят по

800 мл инокулума, затем ведут культивирование в течение 24 ч при 30 С.

Затем 1-метил-5-меркапто-1Н-тетразол растворяют в водном растворе едкого натра и раствор стерилизуют под давлением и добавляют к культивируемому бульону, создав в нем концентрацию этого раствора 0,053, затем смесь дальше культивируют 90 ч.

По окончании культивирования бульон доводят до рН 2,0 затем смешивают с Радиолитом (торговое наименование) при перемешивании. Смесь фильтруют на фильтр-прессе и полученный фильтрат соединяют и получают около 100 л фильтрата. Фильтрат доводят до рН 3,0 водным раствором едкого натра, пропускают через колонку с Амберлитом ХДП-2 (торговое наименование) на 12 л и после промывки колонки 30 л воды колонку элюируют 30 л и 504-ного водного раствора ацетона. Злюат упаривают до 5,5 л и концентрат доводят до рН 3,5 разбавленным раствором НС1- и пропускают через колонку с Амберлитом

IRA-68 (хлорного типа)(торговое наименование) на 3 л. Колонку промывают 6 л воды и фракционируют водным раствором (рН 7,2), содержащим

1 М раствор нитрата натрия и 0,1 М раствор ацетата натрия, получают около 5 л раствора, содержащего активное противомикробное вещество

Раствор доводят до рН 3,0, пропускают через колонку с Амберлитом

ХПД-2 (торговое наименование) на

1 л, промывают водой и элюируют

503-ным водным раствором ацетона, получают 400 мл водного раствора, р5 содержащего активное противомикробное вещество. После лиофилизации раствора получают около 54 г сырого порошка соединения II. Сырой порошок подвергают хроматографии на колонке с 800 мл смолы Сефадекс

А-25 (уксусно-кислого типа)(торговое наименование) с небольшим количеством 0,5 М буферного раствора аммоний-бромида в уксусной кислоте для фракционирования активного компо35 нента, Противомикробно активные фракции собирают, пропускают через колонку с Амберлитом ХПД-2 (торговое наименование) на 500 мл, колонку про4О мывают водой и элюируют 253-ным водным раствором ацетона. Фракции, активные против микробов, собирают и выпаривают в вакууме досуха.

Образовавшийся осадок подвергают хроматографии на колонке с микро45 кристаллической целлюлозой (Авицел) (торновое наименование), заполненной смешанным растворителем изопропанол: вода (7:3 по обьему), применяя систему растворителей, как указано выше.

Полученные активные противомикробные фракции собираю, каплями наносят на тонкослойную пластинку Авицелла SF (торговое наименование), обрабатывают системой растворителей бутанол: уксусная кислота:вода (6:1,5:2,5 по обьему) и на пластинку разбрызгиBBIoT 0,25/-ный раствор нингидрин-пи,ридина, затем нагревают для вызыв-"

904533 14 соединения 1I и, подвергая его очистке также, как и в примере 2, получают около 37 мг 7-(5-амино-5-карбоксивалерамидо)-3-(1-метил-1Н-тетраэол-5-ил)-тиометил-7-метоксиз

-Ь -цефем-4-карбоновой кислоты (соединения I).

Пример 3. Капсулы с сухим веществом, содержащие 120 мг 7-(5to -амино-5-карбоксивалерамидо)-7-меи токси- 3- (1-метил-1Н-тетразол-5-ил)з тиометил-Ь -цефем-4-карбоновой кислоты.

В каждой капсуле содержится, I5 мг

13 ния окрашивания. Затем фракции с

Rf = 0,31 собирают. Фракции упаривают в вакууме и сушат, полученный остаток подвергают хроматографии на колонне с микрокристаллической целлюлозой (Avicel)c использованием смеси растворителей вЂ” изопропанол: бутанол:уксусная кислота. вода (объе ное отношение 21:3:7:9). Полученные фракции, обладающие антимикробной активностью, подвергают тонкослойно хроматографии íà Avlcei SF (торговая марка), используя смесь растворителей того же состава, что был ука зан выше, а затеи, следуя той же операции, которая описана выше, собирают фракции с Rf 0,39 и выпаривают их в вакууме досуха, Полученный при этом остаток хроматографируют на колонке с zo микрокристаллической целлюлозой с применением смеси растворителейбутанол:уксусная кислота:вода !объемное отношение,б:1,5:2,5),.чтобы осуществить очистку активного компо- И нента. Очищенную таким образом фракцию упаривают в вакууме досуха, растворяют s малом количестве дистиллированной воды и разделяют на колонке с Sephadex G 10 (торговая марка) с использованием дистиллированной воды. Фракции, обладающие антимикробной активностью, собирают и подвергают тонкослойной хроматографии с использованием смеси растворителейбутанол:уксусная кислота:вода (объемное отношение 6:1,5:2,5), как указано выше. После этого собирают фракции Rf 0,31, концентрируют, лиофилиэуют и получают около 60 мг 40 белой 7-(5-амино-5-карбоксивалерамидо)-3-(1-метил-1Н-тет азол-5-ил)-тиометил-7-метокси-Ь -цефем-4-кар" ароновой кислоты.

Пример 2. По той же методи- 4> ке, которая использовалась в примере 1, в данном примере, используя раствор бис(lметил- 1Н-тетразол-5-ил)-дисульфид, приготовленный растворением последнего в воде, содержащей метанол, и стерилизованный фильтрованием через тонкопористый (MIlIipore) фильтр, вместо раствора 1-метил-5-меркапто-1Н-тетразола, приготовленного растворением его в воде с использованием водного раствора гидроокиси натрия, при стерилизовании его при высоком давлении, получают 26 г неочищенного порошка

7 (5-Амино-5-карбокси" валерамидо) -7-метокси-3- (1-метил-1Н-тетраэол-5-ил)-тиометил-Ь -цефем-4-карбоновая

3 кислота 120

Лактоза 20

Стеарат магния 5

Капсула У 3. 7- (5-амино-5-карбоксивалерамидо)-7-метокси-3-(1-метил-1Н- тетразол-5-ил)-тиометил-, -Ь -цефем-4-карбоновую кислоту измельчают до порошка Ю 60, затем лактозу и стеарат магния просеивают через тканевое сито h 60 на полученный порошок, 10 мин перемешивают все ингредиенты и заполняют этой смесью сухие желатиновые капсулы

Пример 4. Таблетки, содержа щие по 150 мг 7-(5-амино-5-карбоксивалерамидо)-7-метокси-3-(1-метила

-1H-тетразол-5-ил)-тиометил-Ь -цефем-4-карбоновой кислоты.

Таблетки содержат, мг:

7-(5-амино-5-карбоксивалерамидо)-7-метокси-3-(1-метил-1Н-тетраэол-5-ил)-тиометил- Ь -цефем-4-карбоновая

3 кислота 150

Кислый фосфат кальция IP 115

Стеарат магния 3

Лактоза IP 39

Активный компонент смешивают с фосфатом кальция и лактозой,смесь гранулируют с 153 клейстера из кукурузного крахмала (4 мг ) и просеива ют через грубое сито, сушат при 40 С ав ° Е и снова просеивают через сито h 6, прибавляют стеарат магния и прессуют в таблетки, примерно 8,5 мм в диаметре.

Пример 5. Парентеральный раствор, содержащий 500 мг 7-(5-ами" но-5-карбоксивалерамидо)-7-метокси-3-(1-метил-1Н-тетразол-5-ил)-тиоме3 тил- Л -цефем-4-карбоновой кислоты.

В каждой ампуле содержится 500 мл

7-(5-амино-5-карбоксивалерамидо)-7-метокси-3-(1-метил-1Н-тетраэол-5-ил)-тиометил-Ь -цефем-4-карбоноз вой кислоты. о

Активное соединение (50,0 г) прибавляют в 150 мл стерильной для инъекций воды, полученный раствор доводят до рН 8,0 с помощью разбавленного раствора гидроокиси натрия 15 и объем раствора доводят до 200 мл.

Это количество раствора делят на

100 ампул, лиофилиэуют и запаивают ампулы.

90453

20 г5

4О

45 ляя в него гидрат окиси натрия, и ли50 офилизируют раствор с получением соответствующих натриевых солей.

Характеристики полученных солей, такие как цветные реакции, ИК-, Уф-, ЯИР-спектры, показатели преломления, 55 данные хроматографии на бумаге и жидкостной хроматографии, данные по растворимости идентичны характеристикам соответствующих свободных кислот.

Пример 6. Питательную среду, состоящую из 13 крахмала„ 13 глюкозы, 1,53 соевой муки, 0,54 экстракта дрожжей, 0,1 кислого фосфата калия и 0,054 сульфата магния, помещают в 500 мл сосуды Сакагучи в количестве 100 мл и стерилизуют в течение 20 мин при 120 С. Затем в каждую емкость высеивают культуру Streptomyces clavuligerus IF

013307, после чего проводят культивирующую в течение 72 ч при 27 С.

Далее указанную культуру в питатель.ной среде асептически переносят в серию из 100 колб Эрленмейера емкостью по 500 мл, содержащих по 50 мл раствора, состоящего из 3i крахмала, 1,54 соевой муки, 1,51 коробочек хлопка, 0,45 цитрата натрия, 0,063 сульфата магния и 0,054 гидрата сульфата трехвалентного железа, после чего культивируют при встряхивании при 27 С. По истечении 24-х часов готовят раствор 1-метил-5-меркапто-1Н-тетраэола согласно способу, 1 описанному в примере 1, стерилизуют этот раствор при высоком давлении и добавляют в питательную среду, доведя ее концентрацию до 0,63, после чего кулЬтивирование полученной смеси продолжают еще в. течение

160 ч. После окончания культивирова. ния питательную среду отфильтровывают способом фильтрования под дав" лением и получают 2,5 л фильтрата. рН фильтрата доводят до значения, равного 2,0, промывают его равным количеством этилацетата, пропуска" ют через 50 мл колонку Дауэкс 50 В

3 16 (торговое обозначение), промывают в ней водой и элюируют иэ нее вещество 125-ю мл 0,2 И раствора фосфата натрия (рН = 4,6). Элюированный раствор концентрируют и разделяют на колонке с микрокристаллической целлюлозой, откуда вещество элюируют смесью н-пропанол:метанол:вода (7:0,5:2,5 по объему), получая таким способом водный раствор, содержащий микробиологически активный продукт. Аналогичная процедура проводится также с использованием смеси н-бутанол:уксусная кислота:вода (4: 1:2 по объему), При лиофилиэации раствора получают таким способом

29,5 мг порошкообразного неочищенного соединения, Неочищенное вещество очищают методом жидкостной хроматографии (хроматограф Хитачи 2160, катионная ионообменная смола, 0,2 М буферный раствор цитрата с рН = 3,6, скорость потока 0,6 мл/мин, скорость движения диаграммы 1 cM/мин).

Иикробиологическая активная фракция с временем элюирования, равным

6 мин, собирается, концентрируется, после чего лиофилизуется, в результате чего получается 4,9 мг 7 -(5-амино-5 -карбоксивалерамидо)-7 -метокси-3-(1-метил- 1Н-тетразол- 1-ил)8

-тиометил- Ь -цефем-4-карбоновои кислоты, имеющей белый цвет.

Аналогичные операции проделывают с использованием культур Step

rochei 12908, йrep.. 1impanii IFO

13306 и Strep. viridochromgenes

IF0 13347 вместо культуры Strep.

cIavu1igerus IFO 13307 и получают соответственно 28,23 и 25 мг неочищенного продукта и соответственно

3, 7 и 5 мг очищенного продукта.

Пример 7. Каждый из продуктов, полученных согласно опытам, растворяют в малом количестве дистиллированной воды и доводят рН раствора до значения, равного 6,0, добав9О4533

18.

Воздушный

° мицелий

Растворимый пигмент

Среда

Культура

Агар Чапека

Скудный белый

Нет

Глюкозаагар Чапека

Слабый, желто-серый

Нет

Очень слабый

Глюкоза-аспарагиновый агар

Хорошая, белая

Нет

Плохой, белый

Глицерин-аспарагиновый агар

Нет

Плохой, желтосерый

Нет

Тирозиновый агар

Хорошая, светло-нелтый

Бедный, желтосерый

Хорошая, светло-желтая до желто-коричневой

Питательный агар

Хоровая, светло-желтоЛегкий, желтокоричневыи коричневая

Агар Беннета

Очень слабый умеренная, кремовая

Нет

Картофельная пробка

Хорошая, свет- Хороший, желло-желто"корич,- то-серая до невый коричнево-. серого

Нет

Кровяной агар

Нет

Хорошая

Сывороточная среда Лоффера

Неорганический соле-крахмальный агар

Железо и дрожжевой экстракт, тирозиновый агар

Агар из малеата кальция.Очень плохая, белая

Хорошая, кремовая

Хорошая, белая до желто-белой

Хорошая, желто-серая до светло-коричневой

Хорошая, светло-желтый, коричневый

Хорошая, оливково-серой до темно-оливкового

Плохой, белый до желто-белой

Хороший, коричнево-белый до желтосерого

Хороший, порошкообразный светло-оранжевый до светло-коричневого

Хороший, . коричнево-серый, светло-оранжевый до розового

Таблица 1

Немного, светложелтовато-серый

Очень слабый, светло-коричневосерый

Коричнево-серый до темно-rxemorq

Желто серый до темно-красного, коричневый

904533

Таблица 2

Втаим

Характеристика

1"G 19 2

S. cjlobisporus

0,45-0,6 0,55-0,9

1,2-1,4þ1,8-2,0 или

0,9- 1,4 сферические

Размер спор, мк

Желтая до зеленожелтой

Нет

Положительная

Утилизация рамнозы

Гидролиз крахмала

Отрицательное

Положительное

Таблица 3

Предлагаемое соединение

Цефалоспорин С

Штамм

Sarcina lutea

АТСС 9341

Sarcina lutea

АТСС 9341

14,0

12,8

23,1

10,4

18,7

Escherichià соl i Й1Н1

Klebsiella pneumoniae

1310

23,5

25,2

Salmonella gallinarum

17 5

20,2

19,8

23,0 и а »а аааааааааааааааааааааааааааа«аааааoаа

Растворимый пигмент или глицерин-аспарагиновая среда

Коагуляция молока

Пептонизация молока

Продуцирование цефалоспориновых антибиотиков

Staphylococus aureus 209P

Bacillus subtiris ЛТСС 6633

Proteus vulgaris ОХ 19

Proteus mirabi1is IMF 0M"9

Отрицательная

Сильный

Положительная

Слабая

Слабый

Отрицательная

Сильная

904533

Формула изобретения

-(1метил-1Н-тетразол-5-ил)-тиометилвЂ” Ь-цефем-4-карбоновой кислоты или з ее солей со щелочными металлами формулы оса, НОО С вЂ” СН-(QH2) -Щ КД

3n . ОФ

1 где И - атом водорода или щелочного металла, отличающийся тем, что, культивируют продуцирующий 7-меток- 15 сицефалоспориновый антибиотик микроорганизм, принадлежащий к виду

Streptomyces, в культуральной среде

9 содержащеи питательные вещества, с добавлением 1-метил- 1Í-тетразол-5- 2î

-илтиола формулы lt вЂ” М!

H6 N "

СН, 2S

Составитель 3, Латыпова

Редактор П. Макаревич Техред t1.Íàäü Корректор М. Пожо

Заказ 177/49 Тираж 504 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, W-35, Раушская наб., д.4/5

Филиал ППП "Патент",, г.Ужгород, ул.йроектная, 4

1. Способ получения 7-(5-амино-5-карбоксивалерамидо)-7-метокси-3м вЂ” ж