Способ культивирования гибридом
СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ П1БIРВДОМ на питательной среде с добавлением сыворотки животных, отличающийся тем, что, с целью увеличения продолжительности продуктивного периода синтеза антител, в качестве сыворотки животных используют свиную сыворотку.
СОЮЗ СОВЕТСНИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ
РЕСПУБЛИН
„„SU„„1109437
Э(5И С 12 15/00
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ г
Ь а
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР
ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНЯТИЙ (21) 3597399/28-13 (22) 25.05.83 (46) 23 . 08. 84. Бюл. У 31 (72) Ю.А.Манцыгин и Н.В.Святухина (71) Институт биологической физики
АН СССР (53) 576.8(088.8) (56) 1. Jelton D.Е. et а1. Current
topics in Microbiology and Immunology.
1978, 8 1, р. 1-7.
2. Astaldi G.C.Â. et al. Protides
of the biological fluids. 1980, р.28, р. 443-458 (прототип). (54) (57) СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ГИБ, РИДОМ на питательной среде с добавлением сыворотки животных, о т л и ч а ю шийся тем, что, с целью увеличения продолжительности продуктивного периода синтеза антител, в качестве сыворотки животных используют свиную сыворотку.
1 109,37
Изооре ение Отнаситcя K I:è. (уналсгии и касается с((особH куль (((вл(уова— ния In vi (ro 1 исрицам (искус с f Bp ((I(Î созданных гибридньгх клеток, прог!уцирую(((их ltlol(QKлспальепlp антител (g H
1 может найти применение в медицине, ветеринарии, вирусологии, онколоп!и, биахиы(и, бистехналО!"ии дт(я г!ОхГГ е— ния определенно заданных мс.(оклональных антител, которые используются, 10 например для ранней диагnoc !Л(ки р(ка и других заболеваний как человека, так и животных; для высокоэффективной ачистк 1 H г!олучения биологически активных белков (например, Hllтер- 15 ферона), для химио- и иммунотерапии, В 1975 г созданы сомаги(еские
1 иб риды к IP To ê м. 1(. к спи таю((!их (! H б ри— домы), кс (орь(е продуцировали "чисtt тые или монакло((ат(!.Нь(е антитела. 20
Препараты монoклоналl n(.(x «(тител
nOJI G(OT JIH6O Hз BCUH (((OH жидКОСТИ при культивировании гибридом (n v(.vo, либо из культуральной жидкости (клеточный супернатант) при культивировании гибридом 1П (1:1 о. Для этогo отбирают те гибридомы, которые обладают наибольшей стабильностью и высо— кой продуктивность(о. Под стабиль30 ностью подразумевается длительное сохрал(ение способности к образованию антител (т.е. антителопродуцирующей способности) при непрерывном культивировании. Продуктивность †эта спо35 собность клеток клона производить определенное количество антител. Ста— бильные клоны с разной продуктивностью удается получать на раннем этапе выделения гибридом, но зпачитег(ьная часть клонов (мажет быть 2-3)
40 обычно теряет способность к синтезу антител через 3- !О недель непрерывного культивировании. При этом утрата основного признака не зависит ог cIIo
А саба куш:ьтивирования in vivo (асцигная форма) или in vit(:o. 3TO является одним из основных факторов„ препя т с тlз ующих Ip Омьшгп е lпl Ол(у и олуч с 1(H(0 моноклональных (антител. Нужно отметить, что межвидовые гибридомы (мьгнь х человек, крыса х человек и т.д.) являются всегда нестабильными,так как происходит быстрая элиминация хромосом человека. Поэтому увеличение продолжительности продуктивного периода синтеза а((титег(такими гиаридомами хатл бы на несколько педель
i является боль!пил(успехом.
ИзвестPH способ культивирования гиб ридом на питательной среде Д11Е(1 (питаTPJ.ьная среда Игла, модифицирован гая Дальбекко) с добавлением эмб— рианал(.;.ай сыворотки коров 1 1 1 °
11едос-,атак этого способа заключаст; » в -(см, что при !(епрерывном культ(вирсвании гибридом в такой питательной среде они теряют свою
ИГXOtt((y(O аНТИТЕЛСГ(РОДУЦИРУЮ(ЦУ(0 СПО собпост(.. (стабильность) через 310 недель культивирования (в зависимости от свойств гибридомы) . Другой недостаток этого способа состоит в ь(еабходил(остл! добавлять в питательную среду эмбриональную сыворотку корав, каторая является весьма дорогостоящим и дефицитным компоненT Q l и и т а т с г(ы 1 О (! с р е д ьl .
Наиболее близким к изобретению по тех((1(чсскай сущности и достигае(ому результату является способ культивирования гибридом на питательной сре,",е Д11121 с добавлением эмбриональ:-:ой сыворотки коров и человеческих э((дотели((льных клеток или их клеточного супернатанта (IIECS) . Добавление н (п(татег(ьную среду для гибридом че(овеческих эндателиальных клеток или их к.(сточного супернатанта позволяет уBefï-чить период способности продуцировать антитела при непрерывном культив((рован(!и гибридом на 3—
А недели (так, клон гибридомы, полученной пссле слияния человеческих лимфоцитсв H Бп 2/Π— Ag 14 миеломными клетками мышей, сохранял способность пролуцировать антитела при непрерывном культивировании его в питательной среде, содержащей человечес -i- å эндотелиальные клетки в течение 10 педель, в то время, как тот же клон, культивируемый без такой дсбавки, сохранял способность продуцировать антитела только в течение 7 недель) L 2 1 .
Недостаток известного способа состоит в том, чта гибридомы сохраняют свою CTàáHJ(I íoñòl не более 12 недель.
Кроме того, для его осуществления необходимы (кроме дефицитной эмбриональной сыворотки коров) эндотелиальные человеческие клетки, которые получают из пупочногo канатика (вены) эмбриона человека. Это очень асложпяет и удорожае". осуществление способа и ограничивает его применение при (-.руп((ол(асштабнсм культивировании.! 109437
Целью изобретения является у 3(>!,— чение продолжительности продуктивного периода синтеза антител гиб-.I(poмами, путем создания селективного преимущества для антителопродуцирующих клеток.
Поставленная цель достигается тем, что согласно способу культивирования гибридом на питательной среде с добавлением сыворотки жиготных . в качестве сыворотки животных используют свиную сыворотку.
Нестабильность гибридом, т.е. потеря ими способности г(роизводить антитела, связана с общей тенденцией клеточных гибридов потерь хромосомы в процессе их культивирования. Так, для гибридомы мь(шь х мышь утрата клеткой хотя бы одной хромосомы нз трех, в которых находятся все гены иммуноглобулинов у мышей, ведет к утрате этой клеткой признака антителообразования, а затем в процессе дальнейшего культивирования весь клон теряет этот признак, поскольку для многих клонов гибридом селективное преимущество имеют клетки, утратившие способность образования антител. Таким образом, повысить стабильность гибридом можно лишь созданием условий, в которых бы селективное преимущество имели антителопроцуцирующие клетки. Взято 3 клона гибридом (мышь х мышь), полученных известным способом, которые культивировали в среде ДМЕ(1 с добавлением
5%-ной свиной сыворотки и параллельно в этой же среде, »о с добавлением 10%-ной эмбриональной сыворотки коров. Концентрации сывороток выбрав ны с таким расчетом, чтобы не было различий в скорости пролиферации и в конечном урожае клеток в 1 мл .
Периодически проводили тестирование клеточных супернатантов для определения антителопродуцирующей способности клонов. Результаты этого продолжительного опыта (9 мес) показали, что; а) клоны гибридом различаются исходно по своей стабильности и продуктивности; б) из трех клонов два клона потеряли антителопродуцирующую способность через 4-9 недель культивирования в .среде с эмбриональной сывороткой коров; один из них при культивировании в среде со свиной сывороткой сохранял исходную активность в течение всего опыта (т.е.
9 мес), активность второго (Н14), ВС > / (,i <, i. т j E; Ã i ><, . <(<3:>1< <1.< до рл с талл HQ 3-- < порядка и ос т!3(<,I:!(3:! > ! (! БЫ(ОК Î(; x< (< <3 т<Е <(0 К OI(I(!L Оп(>(т а
ТПЕТ«< ((! "< (3К>т Л<тсч I!C. :ОП!iO
< БЫСÎI; О("ТабИЛЬН<1,1 !(БьтССКОЛ,ТИБ«ЫМ и 0cò ÿвл,!!сн I 3 к(< I при культи вирова
« < « < <- (-« -! < 0; < ь .3 О т(л 1 (! 1 <е (>1 О б е 1 < х c!>IV> o p o— тОк; Г ) 13(i( 10 ХОЛЕ!;<Г;л т В ССЗ .,ЛЕТ СЕЛЕКтИБНЫ ЕИЕЕтн.; Е(.тВЛ 15 д.т((ант Ize Пример 1, Куле«<-11(3< р(тв((1((1(3 гибрипсмь(НА12.21.9. ! И<я !(т> <Еь-<(<<<1<30 .:! !Б! Г !1(. j< -i!> 3 013;1 Н ЫХ фа ГО(, <т, С Мl; Е.—.. .-((т. (Н<>(ЕИ (ЕЫШ1(Н Ы((И клеткамтт Нр 2/0 — Л< /14 и последуюL!cãî отбора гибриднсгс клона, облл25 дл((<це(о способность((3 продуцир(вать а>НТ((ТЕЛЛ В фЛГу,!. ТИтр ЛНТИтЕЛ Б суп ернлтае(тс (т. е. Лнт((телопро(<(уцирую<:(ую способность гибридомы) определяли известнь!м способом. ИсхопЗо ная лнтителоиродуцирующая способ— ность гибридсмы 12.21.9 выражена в ((сд % инлктивированнсго фл":л ,"— 1(0.-(<(0c L D> ф«т(свых члс т(TJ (250 -.«ц) инактивируется 100;-: фаго;II» тас<> (1! Ц . Суcëåíçèlo !(сходи(>!х кле 0!(гибр((доН<(12.21.9 разделили на две -<асти. К: c òêl! каждой порции отмь(ли центрифуг((рованием (5 мин, 1000 об!<мин) Б бессь(ворото ПЕой среде Д111:(1 (среда ДЛГМ вЂ” известная среда Иге!л, мсдифииировлнная Длльоекко) . Первую порцию клеток (5 10 кл) 5 поместили Бо флакон Карреля ((1 60 мм), содержащий 10 мл среды ДНЕМ с добавлением 5%-ной свиной сыворотки, ИСПОЛЬЗОБЛЛИ СБЕЕНУЮ СЕ>ЕБОРОТК т< ° ПО— л; тенную от животных в возрасте 8 мес, стерилизованную фильтрован.1е 1 (фильтр Миллинор О, 22 и) и 55 инактивированную нагреванием до 56 С в течение 30 мин. Свиную сыворотку добавляли в концентрации 5%р обеспечивающей такую же скорость пролиферации и конечнь(й урожай клеток 1),- 0 т) /, q ! В 1 М)7 КЯК -!О Об? ) Ч!т?3ат?> !? .. if< >я концентрах?ия эт!б)?)1 0)т ?ньной сывОГ)от" ки f КуХ!ЬТИВИ!3О?)Я!!И?! Гибрн?тОЬ!) !! К?тпт,тиВировали при обычнь>х yñrroâ!Iÿõ l (-"37 С, содержание. СО. )3 атмосферном воздухе от 5 до 107) до обра3nвания монаслоя (чере3 2-3 .ут куль-тивирования, = 1 -l0 I-7) и Вновь 6 пересевали в такой же про!?орци!! „ ХО Б ПРОЦЕССЕ НЕ?!РЕ>РЬ!В!!ОГО КУЛЬTHI)rrPOвания гибртптомпого к;:fîíä е)ке!?е,?Хельllo проверяли его антителопроду >ирук)щу ю с х! 0 с О б ность, к О op cf )l т р е,тт с а Б -. лена rra фиг, 1, кривая 1. Как ви?но х?з это?! к>)ттв?)й кь:т!>тl! !3>r!) >)?3!> ни! г ибридомы И т! 12,,71,?7 па питательной среде с доба в.!тен!Хе?ч < лино:-"1: ь .Ворот-ки 170эволяет сохра:!Нть ее !токо?>Н5 !о антителопродуцпрующу!о способность на протяжении (!Хо крайней мере) 40 недель непрерывного культи?)1?ро!Ха?!1>я. ,т?ля с1)Я13!!е!Ня 13Т:!p»r?) Нор ти?о клсток (5 10 кл) гибр!>домы И Л 12.21,9 выращивали параллельно па такой же ! Хитательпой среде ДНЕ?1 с добавлением 107-ной з fC5pHoHBJ?Iirfoé сыворотки Kci ров, в таких же условиях и с такой же еженедельной проверкой антителопродуцирующей способности непрерывно 30 культивируемого клона, Результаты, определех!Ия аí THтелollpодуцирующей способности гибридомы. jj 77 12. 21. 9 при ее непрерывном культивировалии на питательной средс с добавлением эмбриональной сыворотк!1 коров представлены на фиг. 1,, кривая 2 †. Как ВНДнО из .) тОЙ кР!Хв?)1: т к i.)?ьтиl)иРОВЯ ние гибридомы )?о и-:вестному способу позволяет сохранить ее исходную ан-,1?З тителопродуцирующую способность голько в течение 3 и:-, ?ех ь,. Уже через 7 недель такого ку:?!>-:.:-вировяния антителопродуцпрующая с?!особность уменьшилась в 10 p.":.з !,Точка 1 на ОСИ y"), T . F ., ff TFròl!IOOTb СУттЕРНЯт !F!Td. „ вираже?!Ная D от: 7? Ннактивированногo ф?1ГЯ /I ) РЯВНЯ 1 ) 1 1 О ОЗН11 "1ЯЕT т ЧТО при добавлении О, 3 ь?т! суттернатанта К 250 фаГОВЬтМ ХЯСГИ??т-ХМ ИНЯКтиннруЕтСя go 107. фяговь!х частиц, а срез 9 недель к5льтивирования антlfT!. :.:.Io!7poff5 ци!)5>!0-" ЩЯЯ ЯКТХ!Х)Х!ОСТЬ ИСЧЕЗЯ? т СОВСЕМ (?3E>Iживает 100/ фаговы частиц). П р и м е ?) ?, Культивирование гибридомы ! "-- ° Об ДПЯ l:Ут!)-,ТИВИРОВЯНИЯ FrCVOЛт,ЗОВаттИ т;летки гибрид?)мы j! Л l4 36.0., полученНОИ Ках 011ИСЯНО В ПГ>тМЕ>ВЕ Титр антител в супернатанте,опре:?еляли ffçrfoñòíûì способом. Исходная «нтитет?опродуциру!ощая способность гттбр»домы Н 3 l4.36.0 вь!ражена в Код 7. инактивированного фага Д и равна 2 (фиг. 2, точка ? на оси у) . Суспензию исходных клеток гибридомы 13 14.36.0 разделили на 2 части; к;!етки каждой порции отмывали центрифугированием в бессывороточной среде Д?»Е?1 и культивировали кажду порцию так же, как описано в примере Еженедельно определяли антителопродуцирующую способность каждого от,!Е.т!Х Но КУЛЬТИВИРУЕМОГО КЛОНа. ГРафИК ЯИТИTå»lorrðoäóöHðóþùåé способности г!!бридомь! при непрерывном ее культивировании представлен на фиг. 2. Как ницно из этого графика, культивироВание гибридомы т!Хт 14.36.0 на питательной Среде с добавлением свиной сь!воротки — кривая 1 не только позволяет сохранить исходную антителопродуцирующую способность гибридомы в течение длительного времени, но, в oar!!roll случае, и повысить ее н l0000 раз. Как видно из кривой 1, после 5 недель непрерывного культивирования гибридомы в присутствии свиной сыгоротки ее антителопродуцирую-!!?Ял способность стала возрастать н на 7-й неделе увеличилась в 10000 раз,. На графике 2 это соотоетствует точке б на оси у, это означает, что при добавлении 0,3 мл нераз веденного супернатанта инактивируется 10 фаговьтх частиц, тогда как на6 чальный или исходный супернатант инактивировал 10 фаговых частиц. Определение антителопродуцирующей активности второй порции гибридомы Н >? 1 1.36.0 при непрерывном культивировании в присутствии эмбриональной сыворотки коров (фиг. 2, кривая 2) показало, что в этом случае исходная активность сохранялась в течение не более 2 недель, и уже через 5 недель культивирования этот клон полностью потерял антителопродуцирующую способНОСТЬ. Таким образом, предлагаемый способ культивирования гибридом в отличие от известного позволяет увеличить продсттОКИТЕЛЬНОСТЬ ПродуКтИВНОГО ПЕрИОда синтеза антител гибридомами в 10 раз и уменьшить стоимость производства антител. i 109437 Составитель В.Кузьмичев Редактор С.Патрушева Техред Ж. Кастелевич . Корректор C.IllegMaP Заказ 6003/18 Тираж 522 Подписное ВНИКАЛИ Госудррствейного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб ., д. 4/5 о Филиал ППП "Патент", r.Óærîðoä, ул.Проектная, 4
