Способ определения экдистерона в культуральной среде

 

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЭКДИСТЕРОНА В КУЛЬТУРАЛЬНОЙ СРЕДЕ, предусматривающий вьщеление из личинки Drosophila virilis последнего личиночного возраста слюнной жгелезы, ее вьщерживание в испытуемой культуральной среде пр.и 20-22°С,приготовление давленного ацетоорсеинового препарата этой железы с последующим анализом спектра пуфов хромосом, о т .лича(щийся тем, что, с целью сокращения определения, анализ спектра пуфов проводят ,в индикаторных участках хромосом с первичной реакцией иа экдйстерон и по . наличию. реакции в участках Х-А-6,. 2-Д-З, З-С-1, 3-0-2, 4-С-4 судят о наличии в среде экдистерояа.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК

09) (И) зC50 0 12 1/32 с

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ

Н ABTOPCHOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ ССОР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3518471/30-15 (22) 04.11.82 (46) 23.12,84. Бюл. Ф 47 (72) Е.В Полуэктова, В.Г.Митрофанов и В.Т.Какпаков (71) Институт биологии развития им. Н.К.Кольцова и Институт общей генетики АН СССР (53) 543.9:595.7(088.8) (56) 1. Полуэктова Е.В., Митрофа- . нов В.Г., Кокпаков В.Т. Действие гормонов насекомых на пуффинг хромосом слюнных желез Drosophila

virilis Sturt., культивируемых

in vitro. Сообщение 1. Изменение пуффинга при культивировании желез в среде С-50. Онтогенез, 1980, т.11

В 2, с. 175-180 (прототип) . (54)(57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЭКДИСТЕРОНА В КУЛЬТУРАЛЬНОИ СРЕДЕ, преду- . сматривающий вццеление иэ личинки .Drosophila virilis последнего личиночного возраста слюнной железы, ее выдерживание в испытуемой культуральной среде при 20-22 С,приготовление давленного ацетоорсеинового препарата этой железы с последующим анализом спектра пуфов хромосом, о т,л и ч а ю шийся тем, что, с целью сокращения времени определения, анализ спектра пуфов проводят в индикаторных участках хромосом с первичной реакцией на экдистерон и по наличию. реакции в участках Х-А-б,, 2-Д-3, З-С-1, З-Ст-2, 4-О-4 судят о наличии в среде экдистерона.

С.

1,0

0,0

Цистеин НСР

Глутамин

Метионин

Холин хлорид

Инозит

Ж-Алании

Перидоксин

Тиамин HCE

50

1 11306

Изобретение относится к сельскому хозяйству и биологии и может быть использовано в практических целях в качестве экспресс-тест-системы для биологически активных веществ, 5

Известен способ определения экдистерона в культуральной среде посредством пуффинга хромосом слюнных

are ca Drosophila virilis. Личинок (30-40 шт.) отбирают из массовых 10 культур в момент 2-й линьки на 48-м часе П? -го возраста, выделяют из них слюнные железы и переносят в культуральную среду С-50 химически определенного состава, культивируют 15 железы в ней 0,5-24 ч в бюксах или пеницеллиновых флаконах, содержащих

1 мл среды С-50 без гормона или с гормонами насекомых. Затем железы переносят в 1Ж-ный раствор ацето- 20 орсеина на 2 ч при 22 С или 12-14 ч

О при 10-14 С, после окрашивания жео лез готовят давленные препараты их по рутинному способу и проводят кариологический анализ дистальной 25 части железы (10 шт.), просматривая экспрессию спектра пуфов в десяти ядрах каждой из желез. На каждом из сроков анализируют в среднем 12200 районов хромосом в среде С-50, ЗО

12400 районов — в среде с ювенильным гормоном, 12200 — в среде с экдистероном. Всего анализируют в среднем 36800 районов хромосом в течение 15 дн., на каждом сроке ин- 35 кубации желез И .

Недостатком известного способа является то, что кариологический анализ его продолжителен, сложен и трудоемок, так как включает в се- 40 бя спектр пуфов всего генома, большинство из которых реагируют на экдистерон неспецифично, т.е. чувствительны как к экдистерону, так и к ювенильному гормону.

Цель изобретения — сокращение времени определения.

Указанная цель достигается тем, что согласно способу определения экдистерона в культуральной среде, предусматривающему выделение из личинки Drosophila virilis последнего личиночного возврата слюнной железы ее выдерживание в испытуемой кульо туральной среде при 20-22 С, приго- 55 товление давленного ацетоорсеинового препарата этой железы с последующим анализом спектра пуфов хромосом, последний проводят в индикаторных участках хромосом с первичной реакцией на экдистерон и по наличию реакции в участках Х-А-6, 2-Д-3, З-С-1, З-Q-2, 4-С-4 судят о нали- ии в среде экдистерона.

Пример. Отбирают личинок

Drosophila virilis во время 2-й линьки. Выделяют слюнные железы из личинок 48-го часа П1 -го возраста в

0,6Х-ном растворе NaC1 Переносят в бюксы (диаметр 25 мм, высота 25 мм) с 1 мл среды С-50 составы (концентрация веществ в мг/100 мл трижды дистиллированной воды):

NaC1 400,0 Лейцин 30,0

КС1 160,0 Аргинин 40,0

ИаН РО 2Н О 50,0 13-Аланин 50,0

NaHC0g 40,0 Глицин 30,0

СаС1 6Н О 5,0 Серин 30,0

NpC12 6Н О 25,0 Пролин 150,0

Трис 300,0 Фенилаланин 20,0

Феноловый красный

Тирозин 3

Лизин НС 100,0

Глутаминовая кислота 80,0

Аспарагино10,0 вая кислота 30,0

100,0 Триптофан 10,0

50,0 Трионин 40,0

5 0 Изолейцин 20,0

0,7 Фолиевая кислота 0,4

50,0 Валин 30,0

0,4 Никотинамид 0,4

0,4 Пантотенат кальция 0,4

Гистидин НС0 40,0 Рибофлавин 0,04

Глюкоза 300,0 Эмбриональная телячья сыворотка 5Х-ная рН 6,9 + 1 мг/мл экдистерона "Serva", ФРГ.

Культивируют железы в течение

30 мин при 20-22 С в герметических

О условиях. Окрашивают в 17.-ном растворе ацетоорсеина в течение 2 ч при 20-22 С или 12-14 ч при 10-14 С.

О о

Готовят давленные препараты желез для чего переносят железу из краски на предметное стекло, краску удаляют; помещают железу в каплю насыщенного раствора хлоралгидрата (5 г в 2 мл воды); быстро (через

3-4 с) смывают его 453-ной уксусной кислотой; помещают железу в каплю 507.-ной молочной кислоты, покрыва1130605

Составитель Л.Чибисова

Редактор Н.Яцола. Техред О.Ващишина Корректор А.Обручар

Заказ 9520/22 ..Тираж 521 Подписное

ВНИИНИ Государственного комитета СССР по делам изобретений.и открытий

113035., Иосква, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал IIIIU "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 ют покровным стеклом, прижимая его к предметному стеклу.

Проводят карнологический анализ пяти индикаторных пуфов в районах

Х-А-6, 2-Д-З, З-С-1, 3-6-2, 4-С-4, по экспрессии которых судят о наличии экдистерона в культуральной среде. В среде без экдистерона индикаторные пуфы не формируются.

Таким образом, предлагаемый способ определения экдистерона в культуральной среде посредством пуффинга индикаторных участков в поли-. тенных хромосомах Drosophila virilis технически прост, сокращает продолжительность анализа в 15 раз (анализ по предлагаемому способу продолжается 1 день, по известному - 15

5 дней) . Объем анализируемого материала сокращается в 73 раза(по предлагаемому .способу анализируют 500 участков хромосом, по известному36800 участков).

Разработанный способ определения экдистерона в культуральной среде позволяет испольэовать индикаторные районы на экдистерон всех насекомых, обладающих тканями с политенным

15 кариотипом.