Способ определения активности сукцинатдегидрогеназы в биологических объектах

 

Изобретение относится к медицине. Цель изобретения - повьшение точности способа. В пробирку с дистиллированной водой вносят кровь, фосфатную буферную смесь, раствор сукцината натрия и раствор тетразолия. Пробы инкубируют и центрифугируют. Осадок очищают от белковых структур крови, растворяют в ацетоне и центрифугируют . Центрифугат фотометрируют и рассчитывают активность фермента. 1 табл. ш ас

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (бд 4 С 12 Q 1/32

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3891964/28-14 (22) 29. 04. 85 (46) 07.04.87. Бюп. 9 13 (71) Ленинградский научно-исследовательский институт радиационной гигиены (72) О.П.Иванова, В.M.Âàñþòî÷êèí, А.Н.Коржавин и И.П.Стамат (53) 612.015(088.8) (56) Кип Е., Abood L. — Scince, 1949, т. 109. с. 144-148.

„„Ь 0„„1301841 А 1 (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ

СУКЦИНАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ В БИОЛОГИЧЕСКИХ

ОБЪЕКТАХ (57) Изобретение относится к медицине.

Цель изобретения — повьппение точности способа. В пробирку с дистиллированной водой вносят кровь, фосфатную буферную смесь, раствор сукцината натрия и раствор тетразолия. Пробы инкубируют и центрифугируют. Осадок очищают от белковых структур крови, растворяют в ацетоне и центрифугируют. Центрифугат фотометрируют и рассчитывают активность фермента.

1 табл.

1301841

Про-. ба

0,480

0,450

0,510

0,480

1,070

1,110

1, ОбО

1,080

А =- 1,18 А. ст инк - сp р моль/мл мин, Изобретение относится к медицине, касается измерения ферментативной активности сукцинатдегидрогеназы (СДГ) и может быть использовано при исследованиях влияния различных факторов окружающей среды на организм человека и животных °

Целью изобретения является повышение точности за счет дополнительной очистки продукта реакции с помощью центрифугирования с последующим растворением полученного осадка в ацетоне.

Способ осуществляют следующим образом.

В пробирку с 1 мл дистиллированной воды вносят 0,2 мл крови и по

1 мл О, 15 М раствора фосфатной буферной смеси, 0,2 M раствора сукцината натрия и 0,1%-ного раствора тетразолия. Пробы инкубируют при

37-38 С в течение 60-90 мин. Продукт реакции отделяют от инкубационной среды путем центрифугирования проб при 3000 мин в течение 15 мин, осадок промывают в 5-10 мл дистиллиро— ванной воды и центрифугированием в течение 5 мин при 3000 мин " очищают от гемоглобина и других белковых стРуктур крови, затем осадок растворяют в 5 мл ацетона и центрифугируют при 3000 мин " в течение 3-5 мин„

Центрифугат, представляющий собой очищенный раствор формазана в ацетоне, фотометрируют, например, на спектрофотометре (3, „„= 475 HM), Активность фермента рассчитывают по формуле

При измерении оптической плотнос— ти стандартных проб на спектрофотометре СФ-18 зависимость D от содержания формазана в стандартной пробе А„ оказывается линейной в интервале значений А„. от О до 100 г/мл.

При определении активности СДГ в тканях вместо смеси 1 мл дистиллированной воды с. пробой крови используют 1 мл 5-10%-ного гомогената ткани. При этом операцию очистки продукта реакции от гемоглобина и белковых структур можно не производить, поскольку в спектре поглощения раствора гомогената ткани спектр Сорета отсутствует. Расчет активности фермента производят по формуле (1), в которой вегичину объема крови V заменяют на вес (массу) ткани в 1 мп раствора гомогената в граммах. Величину активности в этом случае выражают в моль/

/г мин, В таблице показано сравнение результатов определения активности СДГ по предлагаемому способу и способу

Куна-Эбуда (известному). Анализ проводили в пробах ткани печени крыс.

Оптическая плотность проб при определении активности СДГ способом

Куна-Эбуда предлагаемым " где A, — содержание формазана в стан- 45 дартной пробе, рг/мл;

D и 1)„ — оптическая плотность стандартной и исследуемой проб при 1 = 475 нм; !

V --объем пробы крови, мл;

1„.,„— время инкубации при

37-38 С, мин;

Mq — молекулярный вес формазана, р г/ 1чмоль

1,18 — постоянный для предлагаемого

55 способа коэффициент, учитывающий потери формазана при центрифугировании.

Вследствие высокой оптической плотности перед фотометрированием пробы разбавляли ацетоном в соотношении 1:4 (1 мл пробы + 4 мп ацетона).

Формула из обре те ния

Способ определения активности сукцинатдегидрогеназы в биологических объектах, включающий их инкубацию с субстратом в присутствии тетразоля в буферной среде с последующим центРифугированием и фотометрическим

1301841 4 та реакции центрифугированием в течение 10-15 мин при 3000 об/мин с последующим растворением полученного осадка в ацетоне. измерением продукта реакции, о т— л и ч а ю шийся тем, что, с целью повышения точности способа, проводят дополнительную очистку продукСоставитель В. Месянжинов

Техред В.Кадар Корректор И. Эрдейи

Редактор С. Пекарь

Заказ 1191/26 Тираж 500 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4