Вакцина против колибактериоза молодняка крупного рогатого скота и овец

 

(19)RU(11)1149467(13)C(51)  МПК ⁶    _A61K39/108Статус: по данным на 17.01.2013 - прекратил действиеПошлина: учтена за 15 год с 30.07.1997 по 29.07.1998

(54) ВАКЦИНА ПРОТИВ КОЛИБАКТЕРИОЗА МОЛОДНЯКА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА И ОВЕЦ

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии, в частности к способам получения вакцин, применяемых для профилактики колибактериоза (эшерихиоза) сельскохозяйственных животных. Колибактериоз (эшерихиоз) инфекционная болезнь, вызываемая энтеропатогенными эшерихиями, широко распространен во многих странах мира и наносит значительный экономический ущерб животноводству за счет высокой смертности молодняка (телят в первые дни жизни, а ягнят в послеотъемный период), снижения привесов, потери продуктивности у переболевших животных. Основными направлениями в борьбе с колибактериозом сельскохозяйственных животных являются химиотерапия и специфическая профилактика. Однако возникновение резистентных форм энтеропатогенных эшерихий заметно снижает лечебную эффективность лекарственных препаратов. В этой связи, все большее значение приобретает вакцинопрофилактика колибактериоза. В настоящее время по биологическим особенностям энтеропатогенные эшерихии, вызывающие диарею у молодняка сельскохозяйственных животных и человека, условно разделяют на три группы:
а) энтеропатогенные эшерихии, вырабатывающие термолабильные и термостабильные энтеротоксины;
б) энтеропатогенные эшерихии, относящиеся к определенным серогруппам;
в) энтеропатогенные эшерихии, обладающие выраженными адгезивными свойствами, обусловленными наличием антигенов К-88 и К-99. В этой связи для получения эффективного средства специфической профилактики колибактериоза вакцина должна включать:
набор штаммов определенных серогрупп энтеропатогенных эшерихий, наиболее часто вызывающих колибактериоз у данного вида животных;
штаммы, способные продуцировать энтеротоксины, или очищенные энтеротоксины;
штаммы, обладающие адгезивными факторами (факторами прилипания) К-99 К-88 или очищенные К-антигены. Известна вакцина для нативной иммунизации против энтеритной формы колибактериоза, содержащая смесь 4-х штаммов сероваров 0101, 09, 09, 08, инактиватор формалин, адъювант гидроокись алюминия. Однако в связи с недостаточно полным набором липополисахаридов 0-антигена и отсутствием в вакцине экзотоксинов она имеет ограниченный спектр иммуногенного действия и не будет предохранять животных от энтеротоксемической и частично септической форм колибактериоза. Известна также вакцина против диареи, вызываемой E. coli, содержащая водную суспензию полуочищенного антигена К99, полисахаридов К-антигенов, липополисахариды 0-антигена и термостабильного энтеротоксина из штаммов эшерихий сероваров 09: K35:K99; 0101:K30:K99; 08:K85:K99, фрагменты клеток и культуральную жидкость с молекулярной массой больше 1000 дальтон. Однако иммуногенный спектр действия вакцины ограничивается для профилактики энтеротоксемической формы колибактериоза из-за отсутствия термолабильного энтеротоксина. Кроме того, технология изготовления вакцины сложна, трудоемка и требует сложнейшего оборудования. Известна вакцина против колибактериоза телят, ягнят, взятая нами за прототип, содержащая смесь 13 штаммов E. coli сероваров 08, 09, 015, 020, 026, 041, 055, 078, 086, 0101, 0115, 0117 и 0119 в концентрации 24 млрд микробных тел, инактиватор 03-0,4% формалина, адъювант 30% по объему к бакмассе 6% гидроокиси алюминия. Однако вакцина обладает слабой иммуногенной активностью и имеет повышенную реактогенность. Цель изобретения повышение иммуногенности вакцины против колибактериоза (эшерихиоза) телят и ягнят и расширение спектра ее действия. Поставленная цель достигается тем, что вакцина против колибактериоза молодняка крупного рогатого скота и овец, содержащая антигены эшерихий, конвервант на основе формалина и тиомерсала, дополнительно содержит бульон Хоттингена и физиологический раствор, а в качестве антигенов смесь штаммов Escherichia coli ВГНКИ N 305-37/10, Е. сoli ВГНКИ N 355-37/12, E. coli ВГНКИ N 288-37/9, E. coli ВГНКИ N 296-37/10, Е. соli ВГНКИ N 301-37/10, E. coli ВГНКИ N 328-37/11, E. coli ВГНКИ N 289-37/10, E. coli ВГНКИ N 297-37/10, E. coli ВГНКИ N 288/-37/9, E. coli ВГНКИ N 58-37/2, E. coli ВГНКИ N 67-37/2, E. coli ВГНКИ N 59-37/2, E. coli ВГНКИ N 293-37/10, взятых в равных соотношениях при следующем содержании компонентов на 1 л вакцины:
Антигены эшерихий
(клеток) 7,7˙10¹² 9,2˙ 10¹²
Гидроокись алюминия (см³) 280-330
Формалин (см³) 2,8-3,5
Тиомерсал (г) 0,13-0,18
Бульон Хоттингера (см³) 100-160
Физиологический раствор До 1 л
Вакцина содержит штаммы эшерихий 13 серогрупп (08, 09, 015, 020, 026, 041, 055, 078, 086, 0101, 0115, 0117, 0119), которые ответственны за энзоотии колибактериоза у телят и ягнят. Штаммы обладают капсульными антигенами К-99, К-43, К-14, К-30, К-60, К-61, К-62 К-69 и К-80, способны вырабатывать токсины и гемолизины. Штаммы эшерихий, используемые для изготовления вакцины, селекционированы по иммуногенной и антигенной активности. Штаммы Escherichia coli ВГНКИ N 305-37/10, E. coli ВГНКИ N 355-37/12, E. coli ВГНКИ N 288-37/9, E. coli ВГНКИ N 296-37/10, E. coli ВГНКИ N 301-37/10, E. coli ВГНКИ N 328-37/11, E. coli ВГНКИ N 289-37/10, E. coli ВГНКИ N 297-37/10, E. coli ВГНКИ N 288/1-37/9, E.coli ВГНКИ N 58-37/2, E. coli ВГНКИ N 67-37/2, E. coli ВГНКИ N 59-37/2, E. coli ВГНКИ N 299-37/10 депонированы в коллекции микроорганизмов всесоюзного государственного научно-контрольного института ветеринарных препаратов. Штаммы Escherichia coli, входящие в вакцину, характеризуются следующими свойствами. Морфологические свойства: штаммы представляют собой мелкие грамотрицательные палочки без спор и капсул. Размер 1,5-2 мк, ширина 0,3-0,5 мк. Клетки штамма N 305-37/10, N 289-37/10, N 297-37/10, N 288-37/9, N 288/1-37/9, N 58-37/2, N 301-37/10 подвижны за счет перетрихиально расположенных жгутиков. Культуральные свойства: на мясопептонном бульоне все штаммы образуют помутнение через 6-8 ч роста при 37-38^оС. На мясопептонном агаре образуют матовые, круглые, гладкие, мелкозернистые, слегка выпуклые колонии ("S" форма) диаметром 2-4 мм. Ферментативные свойства: все штаммы сбраживают лактозу, глюкозу маннит, арабинозу, ксилозу, сорбит, сахарозу (за исключением штамма N 328-37/11, N 58-37/2, N 59-37/2, N 297-37/10, N 305-37/10, N 289-37/10); рафинозу (за исключением штаммов N 288-37/9, N 289-37/10, N 296-37/10, N 288/1-37/9); дульцит (за исключением штаммов N 297-37/10, N 355-37/12). Все штаммы образуют индол и свертывают молоко. Штаммы N 305-37/10, N 288-37/9, N 296-37/10, N 67-37/2 обладают выраженными гемолитическими свойствами. Антигенная структура: штаммы имеют следующую антигенную структуру:
штамм E. coli N 305-37/10 агглютинируется 0-коли сывороткой 078 в титре 1:6400 и сывороткой К-80 на четыре креста, штамм N 355-37/12 сывороткой 09 в титре 1:3200 и К-30, N 288-37/9 cывороткой 015 до 1:6400 и сывороткой К-14, N 296-37/10 cывороткой 026 в титре 1:12800 и сывороткой К-60, N 301-37/10 агглютинируется сывороткой 086 в титре 1:6400 и сывороткой К-61, N 328-37/11 сывороткой 0101 до 1:6400 и сывороткой К-99 до титра 1:640, N 289-37/10 сывороткой 0117 в титре до 1:12800 и сывороткой К-62, N 297-37/10 сывороткой 0119 до 1: 6400 и сывороткой К-69, N 288/1-37/9 агглютинируется сывороткой 020 в титре до 1:3200, N 58-37/2 сывороткой 041 в титре 1:6400, N 67-37/2 сывороткой 0115 в титре 1:12800, N 59-37/2 сывороткой 055 в титре 1:6400 и N 299-37/10 сывороткой 08 в титре 1:3200 и сывороткой К-43. Вирулентные свойства: величина ЛД₅₀ для мышей, у штамма N 305-37/10 равна 57 млн, штамма N 355-37/12 500 млн, N 288-37/9 18 млн, N 296-37/10 56 млн, N 301-37/10 98 млн, N 328-37/11 380 млн, N 289-37/10 92 млн, N 297-37/10 32 млн, N 288/1-37/9 94 млн, N 58-37/2 75 млн, N 67-37/2 63 млн, N 59-37/2 38 млн, N 299-37/10 79 млн микробных клеток суточной агаровой культуры. Токсические и токсигенные свойства: штаммы N 328-37/11, N 67-37/2, N 297-37/10, N 288-37/9, N 305-37/10, продуцируют термолабильный (ТЛ) токсин, штамм N 355-37/12 термолабильный и термостабильный энтеротоксины. Все штаммы обладают эндотоксинами. П р и м е р 1. Штаммы эшерихий N 305-37/10, 355-37/12, 288-37/9, 296-37/10, 301-37/10, 328-37/4, 289-37/10, 297-37/10, 288/1-37/9, 58-37/2, 67-37/2, 59-37/2 и 299-37/1 засевают каждый отдельно по 0,5 см³ в 200 мл флаконы, содержащие 80-100 см³ бульона Хоттингеpа, имеющего аминного азота 150-250 мг% триптофана 50-100 мг/% и рН 7,8-8,0. Одновременно для контроля штаммов на чистоту их рассевают на чашки с МПА и средой Эндо. Штаммы выращивают в течение 8-10 ч при 37-38^оС. Выросшие культуры проверяют на чистоту известными способами. Чистые культуры раздельно засевают из флаконов в наполовину заполненные бульоном Хоттингера 10 литровые бутыли и культивируют в течение 8-10 ч при 37-38^оС, периодически встряхивая. Полученную расплодку перед засевом в реактор проверяют на чистоту. Штаммы засевают в реактор группами с учетом их колициногенности и выращивают в течение 10-14 ч при 37-38^оС при непрерывной аэрации и перемешивании. По окончании выращивания определяют рН, концентрацию микробных тел и чистоту культуры микроскопией и высевом на питательные среды. Полученную в каждом реакторе бактериальную массу разводят до концентрации 10 млрд/см³ микробных тел и смешивают в одном реакторе. В реактор к смеси культур добавляют при включенной мешалке формалин, разведенный физиологическим раствором 1:1, с таким расчетом, чтобы его концентрация в культуре была 0,3% и тиомерсал в количестве 0,01% Инактивацию культуры проводят в течение 15-16 суток при 37-38^оС. В процессе инактивирования культуру перемешивают. К инактивированной культуре добавляют стерильный 6%-ный раствор гидроокиси алюминия до концентрации 30% к объему и 0,05 г тиомерсала на литр вакцины и тщательно перемешивают. Затем доводят рН 10%-ным NaOH до 7,2-7,4, оставляют вакцину при 18-20^оС и проводят контроль на стерильность. Проверенную на стерильность вакцину расфасовывают при включенной мешалке во флаконы, которые закрывают резиновыми пробками, обкатывают металлическими колпачками и этикетируют. Расфасованную вакцину проверяют на стерильность, безвредность и активность. Содержание компонентов в полученной вакцине следующие: Компонент вакцины Содержание в 1 л
минимум максимум Антигены эшерихий (клеток) 7,7˙10¹² 9,2˙ 10¹² E. coli ВГНКИ N 305-37/10 (серовар 078:К-80) 0,6˙10¹² 0,7˙ 10¹² E. coli ВГНКИ N 355-37/12 (серовар 09: К-30) 0,6˙10¹² 0,7˙ 10¹² E. coli ВГНКИ N 288-37/9 (серовар 015:K-14:H30) 0,5˙10¹² 0,7˙ 10¹² E. coli ВГНКИ N 296-37/10 (серовар 026: К-60) 0,6˙10¹² 0,7˙ 10¹² E. coli ВГНКИ N 301-37/10 (серовар 086:K-61: H32) 0,6˙10¹² 0,7˙ 10¹² E. coli ВГНКИ N 328-37/11 (серовар 0101:К-99) 0,6˙10¹² 0,7˙ 10¹² E. coli ВГНКИ N 289-37/10 (серовар 0117:K-62:H4) 0,6˙10¹² 07˙ 10¹² E. coli ВГНКИ N 297-37/10 (серовар 0119:K-69:Н4) 0,6˙10¹² 0,7˙ 10¹² E. coli ВГНКИ N 288/1-37/9 (серовар 015:K-14:H30) 0,6˙10¹² 0,7˙ 10¹² E. coli ВГНКИ N 58-37/2 (серовар 041) 0,6˙10¹² 0,8˙ 10¹² E. coli ВГНКИ N 67-37/2 (серовар 0115) 0,6˙10¹² 0,7˙ 10¹² E. coli ВГНКИ N 59-37/2 (серовар 055) 0,6˙10¹² 0,7˙ 10¹² E. coli ВГНКИ N 299-37/10 (серовар 08:К-43) 0,6˙10¹² 0,7˙ 10¹² Адьювант:
гидроокись алюминия
6%-ный раствор, см³ 280 330 Консервант:
формалин,см³ 2,8 3,5
тиомерсал, г 0,13 0,18
бульон Хоттингера, см³ 100 160
физиологический раствор до 1 л
П р и м е р 2. Полученную вакцину вводят внутримышечно двукратно коровам и овцематкам за 1,5-2 месяца до отела или окота соответственно, а ягнятам перед отъемом в дозах:
стельным коровам, см³ 10,15 и 15-20
суягным овцам, см³ 3-4 и 4-5
ягнятам перед
отъемом, см³ 1-1,5 и 1,5-2
Вакцину применяют в хозяйствах, неблагополучных по колибактериозу, для вакцинации, стельных коров и суягных овцематок и за 1,5-2 месяца до отела (окота), а также ягнят перед отъемом. Вакцину вводят внутримышечно в область шеи с соблюдением правил асептики двукратно с интервалом 10-15 дней в следующих дозах:
Вид животных Дозы вакцины, см³
первая вторая
Коровы 10-15 15-20
Овцы 3-4 4-5
Ягнята (перед отъемом) 1-1,5 1,5-2
Молодняк вакцинируют перед отъемом не ранее чем в 21-дневном возрасте. Иммунитет наступает через 18-20 дней после первой дозы вакцины и сохраняется у взрослых животных в течение 5-6, у молодняка 3-4 месяцев. Испытание иммуногенных свойств вакцины проводили в 6 хозяйствах на адекватном количестве животных. Контрольные (невакцинированные) группы животных (глубокостельные коровы и овцематки), а также родившийся молодняк находились при аналогичных условиях содержания, кормления и ухода в одних и тех же помещениях и в одно и то же время вместе с опытными животными, родившимися от вакцинированных коров и овцематок. Вакцинацию животных проводили за 1,5-месяца до отела и окота двукратно с интервалом 10-15 дней. Наблюдение за состоянием здоровья телят вели до 10-15-дневного возраста, ягнят до 30-40-дневного возраста. Испытание проведено на 1510 коровах (из них 800 контрольных), 1495 телятах (в т. числе 89 контрольных) и 404 овцах. Результаты испытания показали (табл. 1), что телята от вакцинированных коров заболевают колибактериозом в 63% против 100% в контрольной группе, болезнь у них протекала главным образом в легкой форме и отход телят в этой группе был в 6,2 раза меньше, чем у телят, родившихся от невакцинированных коров. П р и м е р 3. Полученную вакцину сравнивали по иммуногенной активности с вакциной прототипом на 24 стельных коровах (по 12 коров на каждую вакцину) и 4 коровы служили контролем. Вакцинацию проводили за 1,5-2 месяца перед отелом двукратно дозами 10+15 см³ с интервалом между дозами 10 дней. Через 24 ч после рождения и 3-х кратной выпойки молозива телят заражали контрольным штаммом 078:К80 в дозе 4˙10¹¹ микробных клеток. Результаты представлены в табл. 2. Как видно из таблицы, вакцина-прототип обладала повышенной реактогенностью (вызывала хромоту и аборты у вакцинированных коров), а также недостаточно высокой иммуногенностью. Отход телят, полученных от коров, вакцинированных вакциной-прототипом и зараженных контрольным штаммом 078, составил 16,6% при 100% выживании молодняка, полученного от матерей, вакцинированных предлагаемой (новой) вакциной. Предложенная вакцина обладает хорошо выраженными антигенными свойствами, а также широким спектром иммуногенности, что обеспечивает профилактику колибактериоза у телят и ягнят в различных регионах мира.

Формула изобретения

ВАКЦИНА ПРОТИВ КОЛИБАКТЕРИОЗА МОЛОДНЯКА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА И ОВЕЦ, содержащая антигены эшерихий, консервант на основе формалина и тиомерсала и адьювант, отличающаяся тем, что, с целью повышения иммуногенности и расширения спектра действия, дополнительно содержит бульон Хоттингера и физиологический раствор, а в качестве антигенов смесь штаммов Escherichia coli ВГНКИ N 305-37/10, E. coli ВГНКИ N 355/37/12, E. coli ВГНКИ N 288-37/9, E. coli ВГНКИ N 296-37/10, E. coli ВГНКИ N 301-37/10, E. coli ВГНКИ N 328-37/11, E. coli ВГНКИ N 289-37/10, E. coli ВГНКИ N 297-37/10, E. coli ВГНКИ N 288/1-37/9, E. coli ВГНКИ N 58-37/2, E. coli ВГНКИ N 67-37/2, ВГНКИ N 59-37/2, E. coli ВГНКИ N 299-37/10, взятых в равных соотношениях при следующем содержании компонентов на 1 л вакцины:
Антигены эшерихий (клеток) 7,7 · 10¹² 9,2 · 10¹²
Гидроокись алюминия (см³) 280 330
Формалин (см³) 2,8 3,5
Тиомерсал (г) 0,13 0,18
Бульон Хоттингера (см³) 100 160
Физиологический раствор До 1 л

РИСУНКИ

Рисунок 1