Способ получения @ -лизина
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ-L-ЛИЗИНА, включаюп й глубинное культивирование продуцирук)П1их его микроорганизмов на питательной среде, содержащей исг точники углерода, минеральные соли, ростовые аминокислоты, в условиях аэрации при периодическом добавлении питательной среды в процессе культивирования с последующим выделением лизина из культуральной жидкости, отличающийся тем, что, с целью повышения концентрации лизина в культуральной жидкости при одновременном сокращении продолжительности биосинтеза лизина, питательную среду добавляют при оста (Я точном содержании треонина в среде 0,03-0,08 г/л.
СОЮЗ СОВЕТСНИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ
РЕСПУБЛИН (19) (1) ) 4(sl) С 12 Р 13/08
ГОСУДАРСТ8ЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР
ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Н АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 3599266/28-13 (22) 28 02 ° 83 (46) 23.05.85. Бюл. Ф 19 (72) А.М.Босенко, В.И.Огарков, В,Е.Матвеев, А.С.Юдин, А.В.Кузнецо, ва, Н.Н.Якимович, Е.И.Вальгер и Н.П.Богданов (71) Белорусский ордена Трудового
Красного Знамени технологический институт им. С.М.Кирова (53) 576.6(088.8) (56) 1. Способ подпитки в процессе ферментации при производстве лизина.
Проспект ВДНХ СССР Главмикробиопром.
ОНТИТЗИ вЂ” Микробиопром, 1981.
2. Авторское свидетельство СССР
В 498940, кл. А 23 К 1/00, 1973.
3. Авторское свидетельство СССР В 675980, кл. С 12 P 13/08, 1979. (54) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ Ь-ЛИЗИНА, включающий глубинное культивирование продуцирующих его микроорганизмов на питательной среде, содержащей ис-. точники углерода, минеральные соли, ростовые аминокислоты, в условиях аэрации при периодическом добавлении питательной среды в процессе культивирования с последующим выделением лизина из культуральной жидкости, отличающийся тем, что, с целью повышения концентрации лизина в культуральной жидкости при одновременном сокращении продолжительности биосинтеза лизина, питательную среду добавляют при оста точном содержании треонина в среде
0,03-0,08 г/л.
1157059
Изобретение относится к микробиологической промьпипенности, в частности к получению незаменимой аминокислоты L-лизина, используемой и качестве добавки к кормам пля 5 животных и птицы.
Известны способы получения 1-лизина путем глубинного культинирования продуцирующих его микроорганизмов на питательной среде, содер- 10 жащей источники углерода, минеральные соли и необходимые аминокислоты, при периодическом добавлении н процессе культивирования питательной среды, содержащей источники 15 треонина, метионина и других необходимых при биосинтезе лизина веществ с последующим выделением L-лизина из культаральной жидкости. Время начала добавления дополнительных пи- 20 гательных веществ (подпитки), необходимых для роста биомассы и биосинтеэа Е-лизина, определяют по отклонению от необХодимого уровня рН культуральной среды 13, концентра- 25 ции редуцирующих веществ f2) и ряду других показателей.
Однако эти способы не обеспечивают стабильность процесса биосинтеза L-лизина вследствие того, что указанные показатели не учитывают содержание компонентов, определяющих биосинтетическую активность лизина 9 ростовь.х аминокислот с
1 держание которых значительно колеблется в различных источниках сырья.
Наиболее близким к предлагаемому является способ получения L- лизина путем глубинного культивирования его продуцентов на питательной среде э 40 содержащей источники углерода, минеральные соли, ростовые аминокислоты
9 н условиях аэрации при периодическом добавлении питательной среды н процессе культивирования (стериль45 ных водных растворов мелассы и мочевины), причем раствор мелассы вносят при снижении PB в культуральной жидкости по 4,0 - 7,5 7 и раствор моченины — начиная с 24-го часа культивирования Г31.
Однако известный способ не обеспечивает стабильных показателей при биосинтезе L-лизина и они колеблются в широких пределах (уровень накоппения лизина 46-75 г/л в течение
72-96 ч). Это связано с тем, что ауксотрофные мутанты — продуценты лизина, лишь при наличии ростовых аминокислот в среде активно растут и при их утилизации рост культуры прекращается и начинается синтез лизина.
Е;сли в период прекращения роста культуры и начала активного синтеза внести в среду какой-либо источник ростовых аминокислот, то культура начнет перестраиваться на синтез биомассы, а это связано с торможением биосинтетических процессов. Таким образом, способ подачи н ферментационную среду, например, растнора мелассы, содержащей наряду с углеводами ростовые аминокислоты, при определенной концентрации н среде редупирующих веществ (углеводов) не обеспечивает стабильных показателей при биосинтеэе лизина.
Цель изобретения — повышение концентрации лизина н культуральной жидкости при одновременном сокращении продолжительности биосинтеэа.
Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения
L-лизина, включающему глубинное культинировапие продуцирующих его микроорганизмов на питательной среде, содержащей источники углерода; минеральные соли, ростовые аминокислоты, н условиях аэрации при периодическом добавлении питательной среды в процессе культивирования с последующим выделением лизина иэ культуральной жидкости, питательную среду добавляют при остаточном содержании треонина н среде 0,03-0,08 г/л .
Активный синтез лизина начинается после утилизации значительной части ростовых аминокислот и, в частности, треонина. Причем максимальная скорость биосинтеза лизина достигается при сравнительно низкой удельной скорости роста культуры, которая зависит от остаточного содержания ростовых аминокислот и среде, В случае же полной утилизации ростовых аминокислот удельная скорость роста культуры приближается к нулю и скорость биосинтеза лизина при этом снижается. Максимальная скорость
I биосинтез лизина соответствует невысокой концентрации ростовых аминокислот и, в частности, треонина в пределах 0,03-0,08 г/л. Таким образом, начало внесения подпитки, содержащей наряду с угленоцами ростовые аминокислоты, обеспечивает высокие показатели при бпосинтеэе лиэи1157059 на. При известном же способе начало подачи подпитки в зависимости от концентрации углеводов s среде не представляется возможным по отмеченным причинам, Невозможно также получить стабильные показатели би6синте. 2S
0,08-0,12
0,8-1,0
При достижении уровня треонина ° в среде 30-80 мг/л начинают произвоза лизина.
Способ осуще.ствляется следующим обр азом.
Продуцирующие L-лизин гомосерин- tc зависящие микроорганизмы выращивают в лабораторных условиях в колбах на качалке, а затем в посевном ферментере емкостью 1 мз при непрерывной ч аэрации и перемешиванни при 30-32 С, 15 рН 7,0-7,4 в течение 14-24 ч с использованием питательной среды следующего состава, г/л:
Меласса (с концентрацией РВ 46-487) 80-100 2О
L- Треонин (источником является гидролизат БВК и меласса) 0,14-0,18
L-Метионин (источником является гидролизат БВК) 0,04-0,06
NH4CI (источником является нейтролизат БВК) 8-9
1 1Н4Н7 Р04 0,04-0,06 Зо
Мел технический 8-10
Пропинол Б-400 О, 15-0,2
Для биосинтеза Z-лизина посевной материал с концентрацией биомассы
9- 11 г/л в.количестве О 4-0 5 м пе3 35 редают в ферментер емкостью 15 м и проводят ферментацию в аэробных условиях при расходе воздуха 0,7
1,2 м /мин на 1 мз среди при 3032 С, рН среды 7,2-7,6 на питательной среде следующего состава, г/л:
Меласса (по PB 46-487) 135-140
L- Треонин (источником является гидролизат
БВК и меласса) 0,26-0,32
1,-Метионин (источником является гидролизат БВК)
МН4 Н РО4
NH4Cl (источником является нейтроли50 зат БВК) 16-20
Мел технический 5-8
Пропинол Б-400 О, 15-0, 20
Начальный коэффициент заполнения ферментера 35-43Х.
0,045 дить подачу дополнительной питательной среды по 300-400 л через каждые
2-3 ч следующего состава, г/л:
Меласса (с концентрацией РВ 46-487) 500-600
L-Треонин (источником является меласса и гидролизат БВК) 0,20-0,22
1,-Метионин (источником является гидролизат БВК) 0,08-0, 12
NH4 H P04 0,8-1,0
NH Пропинол Б-400 0,15-0,20 Подачу питательной среды заканчивают при коэффициенте заполнения ферментера 0,7-0,8. В процессе подпитки концентрацию PB в ферментационной среде поддерживают 3-5Х, а биомассы 18-22 г/л. По окончании процесса ферментации культуральную жидкость стабилизируют, затем упаривают и высушивают до влажности 8-107. Пример Продуцент L-лизина Corynebacterium g1utamicum Т-3 выращивают сначала на агаризированной питательной среде, а затем в колбах (750 мл) на качалке (250 об/мин) при 30-32 С в 50 мл питательной среды следующего состава, г/л: Меласса (с концентрацией РВ 46X) 8 L-Треонин (источником является гидролизат БВК и меласса) 0,15 L-Метионин (источником является гидролизат БВК) О, 045 НН4С1 (источником является чейтролизат БВК) 8 NH4H Мел технический 8 Пропинол Б-400 0,15 Затем выращивание 0,5 м посевного материала продолжают в посевном ферментере емкостью 1 м с использованием питательной среды следующего состава, г/л: Меласса (с концентрацией PB 467) 8 L-Треонин (источником является гидролизат БВК и меласса) 0,15 1;Метионин (источником является гпдролизат БВК) 1157059 135 NHgC1 (источником является нейтролизат БВК) 8 m @rO+ 0,6 Мел технический 8 Пропинол Б-400 0,2 В процессе получения посевного материала в ферментере поддерживают расход воздуха 1 м /мин на 1 м среды, рН среды 7,0, температура сре- 10 ды 30 С. Полученный посевной материал с концентрацией биомассы 9 г/л в количестве 0,5 м передают в ферментер емкостью 15 м, в котором проводят основную ферментацию., 15 Исходный состав питательной среды в ферментере (с учетом компонентов посевного материала) следующий, г/л: Меласса (с полдержа- 20 нием 46Х РВ) ?;Треонин (источником является гидролизат БВК и меласса) 0,28 L-Метионин (источни- 25 ком является гидролизат БВК) 0,09 ИН Н РОа 1 NH C1 (источником является нейтроли- 30 зат БВК) Мел .технический 5 Пропинол Б-400 0,2 Начальный коэффициент заполнения ферментера (с учетом посевного материала) 0,43Ж, В начале процесса ферментации поплерживают расход воздуха 0,7 и /мин на 1 и среды, рН среды 7,2, температура среды 30 С. По истечении 10 ч ферментации расход воздуха увеличивают до t,2 м /мин на 1 мэ среды и поддерживают рН 7,4. После внесения посевного материаФ ла отбирают пробу из ферментера и определяют начальную концентрацию треонина методом газожидкостной хроматографии, которая равна 300 мг/л. По истечении 6 ч от начала культивирования определяют остаточное содержание треонина в культуральной жидкости, которое равно 150 мг/л. Затем по предварительно построенной табл. 1, отражающей потребление треонина продуцентом лизина в данных условиях культивирования, исходя из остаточного содержания треонина, определяют время, при котором остаточная концентрация треонина в ферментационной среде достигнет 0,06 г/л, Это время равно 9 ч. 1157059! 1 1 1 I Ю CV м л I ь 4Э 0V л Ю «ф 0«I л I D ь 0Ч л ь! I д! л Ю I ь О л С 4 м л ь Ю О .СЧ л 1 1 ь CV м ° \ ь D О <4 Ю ь О л ь Ю С 4 л Ю ь D л Ю Ю м ь л I 1 D (4 м л I ь О 04 Ю < 3 л ь 1 ь Ю Ю D ь 1 I ь. м ь 1 I 1 1 Ю С 4 м л Ю (D О С 4 Ю « СЧ л Ю 1 ь Ю С 4 ь ь 00 ь л ь I 1 ь D л ь 6 Ц 1 1 — — 4 Ю («4 м л Ю1 D О С л D 0V л ь ! D О л D 00 ь л Ю ) ь м ь ь 1 м I ! I ! — 1 I 1 I 1 о О х В х м 1- Б 3 и ° л Q) Ц E w Ю С 4 м л ь Ю О С 4 л Ю О л ь D СЧ л ь ь Ю л D . I ..: ь у) Ю » л cQ х х х! Ф и Щ .О (U х М О о Ю 4 м л ь Ю О С 4 л Ю ь СМ л ь D Ю л Ю Ю Ю Ю м D л ь х Ф х Х 07 О а х а И tf О а 1 Х л ql х I ° О (» х Э tf ю Э Э A A v s О х х О х о х !» О В х Б З и v ф ,О ° л Щ Ю ь л I I ь 3 С Ъ 0 Ю 0l Ю Д 00 Ю л 1 I I Ю с5 1 Р 1 Ь 04 О 00 О\ е ° «ч ч 1 0,21 К 67-му часу ферментации в культуральной жидкости накапливается L-лизина на уровне 48 г/л, что со.ставляет 38,7Х от потребленного сахара. 9 115705 Через 9 ч после начала ферментации начинают подавать подпитку по 300 л через каждые 2 ч следующего состава, г/л: Иеласса (с концентраS цией РВ 46%) 543 L-Треонин (источником является меласса и гидролизат БВК) 10 L-Иетионин (источником является гидролизат БВК) 0,08 ХН Н Р04. 1 ИН С1 25 15 Пропинол Б-400 0,2 В процессе подпитки концентрацию РВ в ферментационной среде поддерживают 3, 5%. Подача подпитки обеспечивает поддержание биомассы на уров- 2ц не 18 r/ë. При достижении коэффициента заполнения ферментера 0,7 подачу подпитки прекращают и в среду вносят 1 г тиамина и 0,5 г дистибиотина. К 55-му числу ферментации в 25 культуральной жидкости накапливается L-лизина на уровне 48,5 г/л, что составляет 37,2Х от потребленного сахара. Культуральную жидкость стабилизируют добавлением соляной кисло-З0 ты до рН 4,5 и 0,2%-ным бисульфитом натрия, затем упаривают, смешивают и высушивают до влажности 8Х. Пример 2. Посевной материал продуцента L-лизина Brevibacterium flavum выращивают как в примере 1. . Биосинтез L-лизина проводят в условиях анапогичных примеру 1. Концентрация L-треонина s ферментационной жидкости перед началом ферментации равна 0,28 г/л. Через 8 ч от начала ферментации остаточное содержание треонина в ферментационной жидкости достигает уровня О, 14 г/л. По табл. 1 по известным концентрациям треонина 0,28 и О, 10 г/л находят время, при котором концентрация треонина в ферментационной жидкости равна 0,08 г/л. это вре мя равно 11 ч от начала процесса Ферментацчи. Через 11 ч начинают noS0 дачу подпитки состава, указанного в примере 1. Таблица 2 Продолжительность операции биосинтеза Операция Концентрация лизина в культуральной жидкости в конце операции,г/л лизина, ч Corynebacterium glutamicum 45 0 54 44,8 47,0 48,0 44,2 48,1 58 Среднее 46,2 Brevibacterium flavum Е-541 48,0 46,7 47,1 66 1.0 45,5 44,5 Пример 3. Выращивание посевного материала и биосинтез лизина проводят согласно примеру 1. При этом начальное содержание треонина в культуральной жидкости при биосинтезе лизина равно 0,32 г/л. После 6 ч ферментации содержание треонина равно 0,17 г/л. Согласно табл. 1 начало подачи подпитки проводят через 10 ч, когда остаточная концентрация треонина достигает 0,03 г/л. К 56-му часу ферментации в культуральной жидкости накапливается L-лизина на уровне 47 г/л, что составляет 35,7Х от потребленного сахара. В табл. 2 представлены показатели при биосинтеэе лизина серии операций, проведенных согласно предлагаемому способу.! 57059! 1 1 Продолжение табл. 2 ) г з Среднее 46,7 Составитель О. Скородумова Техред П.Микеш Корректор Г.Решетник Редактор Н.Яцола Заказ 3282/23 Тираж 525 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5 Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 Из табл. 2 видно, что накопление лизина в культуральной жидкости происходит до концентрации 44,2— 48 г/л за время 53-58 ч продуцентом лизина Corinobacterium glutamicum Т-3 и до концентрации 44,5-48,2 г/л за 64-68 ч продуцентом Вгеч Ъасйег um flavum Е-531. За время культивирования достигается высокий стабильный выход лизина по сравнению с известным способом, использование которого в промышленных условиях, например, на П!ебекинском биохимическом заводе, дает выход лизина 25-357. Предлагаемый способ по сравнению с известным позволяет обеспечить вос производимость высоких показателей при биосинтезе лизина: концентрации лизина в культуральной жидкости 44,2-48, 1 г/л,при использовании культуры Т-3 и 44,5-48,5 г/л — для куль10 туры Е-531, время биосинтеза 55-58 ч для культуры Т-3 и 64-69 ч - для культуры Е-531. По сравнению с базовым объектом, используемым на Ливанском .биохимическом заводе, выход лизина от потребленного сахара увеличился с 3234 до 35-38Х койцен .рации лизина в культуральной жидкости выросла от 37-39 до 44-48 гlл, время ферментации сократилось от 70-75 до 6469 ч прн использовании культуры Е-531.
