Способ получения ферментов

 

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФЕРМЕНТОВ , включаюа1ий экстрагирование скелетной мышцы кролика, обработку полученного экстракта сульфатом аммония с последующими выделением и очисткой целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью одновременного получения альдолазы глицерофосфатдегидрогеназы и глицеральдегидрофосфатдегидрогеназы , экстракцию ферментов проводят 0,03-0,035 М раствором однозамещенного фосфорнокислого калия при рН 8,1-8,3, а обработку экстракта сульфатом аммония проводят при насыщении до 32,4-33%, после чего осадок отделяют и к супернатанту добавляют сульфат аммония до 39,6-40°/о, образовавшийся осадок , содержаший альдолазу и глицерофосфатдегидрогеназу , отделяют, а супернатант обрабатывают сульфатом аммония до 48,9- i 49°/о и вь1деляют глицеральдегидрофосфатдегидрогепазу . (Л

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОИИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ ф .ь

К А BTOPGHOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ

I 2 I 1 3562347/28-13 221 05.03.83 (46) 07.08.85. Бюл. № 29 (72) Ф. Н. Гильмиярова, Н. Н. Постникова, И. К. Шпрунка, Э. А. Калнина и Н. И. Колкина (71) Научп >-производственное объединение

:Биохимреактпв», Всесоюзный научно-исслеni!3aтельски и институт прикладной биохимии и Куйбышевский медицинский институт им. Д. И. Ульянова (53) 615.361.73 (088.8) (56) Penhoet L.,Kochman M., Ruttcr W J.

3solat!on of fructose diphosphate aldofases

А. Band С. — «Biochemistry», 1969, v. 8, N11,,р. 4391 — 4402. (54) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФЕРМЕНТОВ, включающий экстрагирование

„„SU„„> 1710З7 (5ц 4 А 6! К 37/48 скелетной мышцы кролика, обработку полученного экстракта сульфатом аммония с последующими выделением и очисткой целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью одновременного получения альдолазы глицерофосфатдегидрогеназы и глицеральдегидрофосфатдегидрогеназы, экстракцию ферментов проводят 0,03 — 0,035 М раствором однозамещенного фосфорнокислого калия при рН 8,1 — 8,3, а обработку экстракта сульфатом аммония проводят при насыщении до 32,4 — 33%, после чего осадок отделяют и к супернатанту добавляют сульфат аммония до 39,6 — 40%, образовавшийся осадок, содержащий альдолазу и глицерофосфатдегидрогсназу, отделяют, а супернатант обрабатывают сульфатом аммония до 48.9—

49% и выделяют глицеральдегидрофосфат- 3 дегидрогеназу. (171037

Изобретение относится к энзимологии и может быть использовано для получения ферментных препаратов, которые находят широкое применение в качестве химических реагентов в биохимической практике, в технологии лекарственных веществ, а также для энзимодиагностики и энзимотерапии.

Цель изобретения — одновременное получение альдолазы глицерофосфатдегидрогеназы и глицеральдегидрофосфатдегидрогеназы.

Пример I. 1. Мышцы кролика, взятые сразу после обескровливания, хорошо охлаждают на льду, освобождают от жировой, соединительной тканей и измельчают на мясорубке.

II. Экстрагирование. Измельченные мышцы в количестве 500 г смешивают с двукратным количеством 0,03 М раствора одпозамсгценного фосфорнокислого калия (рН 8,1), содержащим ЭДТА (500 мг/мл), и оставляют при 0---4" С на 30--40 мин при частом перемешивании: Затем экстракт отделяют от твердых частей путем фильтрации через марлю под давлением.

III. Фракционирование сульфатом аммония. К полученному экстракту добавляют насыщенный раствор сульфата аммония до концентрации 32,40/о насыщения от объема в течение 40 — 60 мин при Π— 4 С. Насыщенный раствор сульфата аммония добавляют небольшими порциями. Образовавшийся осадок балластных белков отбрасывают цснтрифугированием при 2000 — 2500 g в течение 15 — 20 мин прн 0- — 4 С.

К центрифугату добавляют насыщенный раствор сульфата аммония до концентрации

39,6"/g. Центрифугируют при 2500 — 4500 g в течсние 7 — -10 мин.

1V. Стаоилизация и кристаллизация альдолазы. Осадок, содержащий значительное количество альдолазы, растворяют в 5 мл

0,03 М раствора однозамещенного фосфорнокислого калия, содержащего ЭДТА в концентрации 500 мг/л, при 0 — 4" С, рН раствора 6,4 — 6,6; добавляк>т 3 мл насыщенного раствора сульфата аммония (рН 7,5 — 7,6).

Кристаллизация альдол азы протекает в

3,2 М растворе сульфата аммония в течение 3 — 4 дн. при Π— 4 С.

Перекристаллизация альдолазы. Первичные кристаллы собирают центрифугированием при 3500 — -5000 р в течение 5--7 мин.

Растворяют в 2 мл охлажденной бидистиллнрованной.воды или в охлажденном 0,03М растворе однозамещен ного фосфорнокислого калия. Добавляют 3 мл насыщенного раствора сульфата аммония рН 6,2 — 6,4.

Выход 150 мг из 05 мг мышц. Активность не менее 15,5 Е/мг белка.

Сохраняк т препарат в виде суспензии в

3,2 М растворе сульфата аммония в теченис 8---12 мсс при 0 — -4 С.

V. Получение глицерофосфатдегидрогеназьь

Кристаллизация. Г(осле центрифугирования и отделения альдолазы в надосадочной . жидкости (IV этап) при 20 С через 10 — 12 ч при рН 6,2 — 6,4 кристаллизуется глицерофосфатдегидрогеназа.

Перекристаллизация. Кристаллы глицерофосфатдегидрогеназы отделяют центрифугированием при 3500 †50 g в течение

5 — 7 мин. Растворяют их в 2,0 — 2,5 мл холодной бидистиллированной воды. Добавляют насыщенный раствор сульфата аммония (рН 6,0 — 6,2) в количестве 3 мл. Рекристаллизация протекает при Π— 4 С и заканчивается спустя 2 — 3 дн.

Препарат глицерофосфатдегидрогеназы сохраняется в виде суспензии в 3,2 М растворе сульфата аммония в течение 8 — 12 мес при Π— 4 "С без существенных потерь активности.

Выход 5f мг из 0,5 кг мышц. Активность

l0 Е/мг белка.

VI. Получение глицеральдегидрофосфатдегидрогеназы.

Центрифугат после отделения осадка, содержащего альдолазу и глицерофосфатдегидрогеназу (этап III), насыщают до 48,90/0 добавлением насыщенного раствора сульфата аммония, рН 5,6 — 5,9. Образовавшийся осадок фильтруют через складчатый бумажный фильтр.

Кристаллизация дегидрогеназы фосфоглицеринового альдегида протекает при 20 С в

З0 фильтрате. Начинается через 8 — 10 ч и завершается через 2 — 3 дн.

Перекристаллизация. Первичные кристаллы отделяют центрифугированием при

3500 — 5000 g в течение 5 — 7 мин. Осадок растворяют в 3 — 4 мл охлажденной бидистиллированной воды и добавляют равный объем насыщенного раствора сульфата аммония, рН 5,7 — 5,8.

Рекристаллизация происходит при Π— 4 С, завершается через 2 — 3 дн.

4р Хранение глицеральдегидрофосфатдегидрогеназы осуществляют в суспензии 2,2 М раствора сульфата аммония при Π— 4 С в течение 12 — 24 мес. без существенных потерь активности фермента.

Выход 200,5 мг из 0,5 мг мышц. Актив45 ность 18,6 Е/мг белка.

Пример 2. I. Подготовку сырья проводят аналогично примеру 1.

I I. Экстра ги рова и ие. Измельченные м ы шцы в количестве 500 г смешивают с двукратным количеством 0.032 М раствора однозамещенного фосфорнокнслого калия рН 8,2, содержащим ЭЛТА (500 мг/л), и оставляют при 0 — 4-"С на 30 — 40 мин при частом перемешивании. Затем экстракт отделяют от твердых частей путем фильтрации че55 рез марлк под да влени ем.

III. Фракционирование сульфатом аммония. К полученному экстракту добавляют насыщенный раствор сульфата аммония до

1171037

Составитель В. Ьрусилонская

Техред И. Верес Корректор М. Максимишинен

Тираж 722 11олниснос

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж вЂ” 35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП «Патент», г. Ужгород. ул. Проектная, 4

Редактор В. Петраш

За к аз 4764/3

32,6 /о насыщения от объема в течение 40—

60 мин при 0 — 4 С. Далее так же, как в примере 1.

К центрифугату добавляют насыщенный раствор сульфата аммония до 39,8 /о насыщения. Центрифугируют при 2500 — 4500 g в течение 7 — 10 мин.

IV — VI этапы. Стабилизация и кристаллизация альдолазы и получение ГФД и

ГАФД проводятся аналогично примеру 1.

Выход альдолазы 152 мг из 0,5 кг мышц:

Активность альдолазы 17 Е/мг белка.

Выход ГФД 52 мг из 0,5 кг мышц. Активность ГФД 10 Е/мг белка.

Выход ГАФД 200 мг из 0,5 кг мышц.

Активность ГАФД 20 Е/мг белка.

Пример 3. 1. Подготовку сырья проводят аналогично примеру 1.

II. Экстрагирсвание. Измельченные мышцы в количестве 500 г смешивают с двукратным количеством 0,035М раствора однозамещенного фосфорнокислого калия рН 8,3, содержащим ЭДТА (500 мг/л), и оставляют при 0 — 4 С на 30 — 40 мин при частом перемешивании. Затем экстракт отделяют от твердых частей путем фильтрации через марлю под давлением.

111. Фракционирование сульфатом аммония. К полученному экстракту добавляют насыщенный раствор сульфата аммония до

33% насыщения от объема в течение 40—

60 мин при 0 — 4 С.

К центрифугату добавляют насыщенный раствор сульфата аммония до 40 /р. Центрифугируют при 2500 — 4500 g в течение 7—

10 мин.

IV — VI этапы проводят аналогично примеру

Выход альдолазы 151 мг из 0,5 мг мышц.

Активность альдолазы 15 Е/мг белка.

Выход ГФД 50,5 мг из 0,5 кг мышц.

Активность ГФД 10 Е/мг белка.

Выход ГАФД 201 мг из 0,5 кг мышц.

Активность ГАФД 20 Е/м г белка.