Способ получения малатдегидрогеназы из митохондрий головного мозга

 

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МАЛАТДЕГВДРОГЕНАЗЫ ИЗ МИТОХОНДРИЙ ГОЛОВНОГО МОЗГА, включанхЕЩй вмделение митохондрий и очистку фермента с помощью ионообменной хроматографии, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа и повышения чистоты фермента, очистку фермента проводят с помощью хроматографии на катионите Биокарб, при этом сорбцию проводят при рН 3,9-6,1, а проьывку и десорбцию - фосфатным буферньш раствором последовательно при рН 5,9-6,2; 6,3-6,7 и 6,8-7,2. (Л

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ /7,"

К АВТОРСКОМ .Ф СВИДЕТЕЛЬСТВУ

«.

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21 ) 3645225/28-1 3 (22) 21, 09, 83 (46 } 07, 0 7. 85. Бюл. 9 25 (72) Е.M.Õâaòoâà и А.Гарсия (71) Горьковский государственный медицинский институт им.С.М.Кирова (53) 577.158.4 (088.8) (56) 1,Glatthaar al. The: preparation of the cytoplasmic and mitohondrial forms of malatedehydrogenase

and aspartate aminotransferase. from .pig heart by à single;procedure"Analytical Biodumistry", 1974

vol.57, р.432-451.

2.Kashivamata S., Niuva Г., Katoh К., Higashida Н,, Malate

dehydrogenase of fovine..cerebrum inhihition by bilirubin.-"Journal of

Neurodumi s t ry ." 1975, vol . 24, р.189-191.

„„SU„„1165402 А

4(sl) А 61 К 35/30 / А 61 К 37/48 (54) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МАЛАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ ИЗ МИТОХОНДРИИ ГОЛОВНОГО

МОЗГА, включающий вццеление митохондрий и очистку фермента с помощью ионообменной хроматографии, о т л ич а ю шийся тем, что, с целью упрощения способа и повышения чистоты фермента, очистку фермента проводят с помощью хроматографии на катионите "Биокарб", при этом сорбцию проводят при рН 5,9-6,1, а промывку и десорбцию - фосфатным буферным раствором последовательно при рН 5,9-6,2; 6,3-6,7 и 6,8-7,2.

116 402

Изобретение относится к биохимии и касается способов получения фер,мента мзлатдегидрсгеназы из митохондP рий гслсвйсгс мозга,.

Известен способ получения малатдегипрсгеназы из ткани сердца Включающий гсмсгенизирование ткани, отдел ение супе рн ат ан-. а, высалив ание сульйатсм -::.ммсния отделение Осадка 1 его,epapac=.всрение,, диализ, хроматографию на колонке с карбоксиметилцеллюлсзсй„ получение фракций с малатцегидрогеназнсй активностью, диализ фракций, хроматографию на колонке с сефадексом д-100 11 ).

Недостатками способа являются его многостадийнссть, относительно .:-:Нзкая чистота целевого продукта, низкий Выход.

Известен способ получения малатдегидрсгекс.зы из митОхсндрий ГОЛОВ кого мозга, .включающий выделение митохондрий и Очистку фермента с помощью иснссбменной хроматографии(2).

К недостаткам известного способа

ОтнОсятся высокая трудсемкОсть и многсстадийность процесса получения целевогс продукта н его низкая удельная ак-.ивнссть.

Целью и-обретения является упрощение спссоба и повышение чисто-. ты целевого продукта.

Поставленная ц чь достигается тем, что псн способе получения малатдегидрсгеназы из митохондрий головного мозга, включающем выделение митсходрий и очистку фермента с помощью ионосбменной хроматографии, очистку фермента проводят с помощью хроматографии на катионите Бискарб, при этом сорбцию проВОДЯТ при ВН 5.9-6,1 а промыВку и десорбцнк — moсфатным буферным раствором последовательно при рН 5,9-6,2; 6,3-6,7 н 6„8-7,2.

П р н м е р 1, Из головного мозпслучают митохондрии по методу

Фонье и Шомсдьи. Общий белок 4900 мг общая ктивнссть 27440 ед удельная активность 5,6 ед/мг белка. Фракцию митохондрий суспендируют в

0,7М сахарозе (рН 7,4) до концентрации 20 мг/мл ь Затем прОВОДЯт центрифугирование в градиенте плотности сахарозы (0,7:1,2:1,5 М) при 60000 g в течение 2 ч. Осадок представляет собой обогащенную фракцию митохондрий. Обший белок

7! 8 мг, общая активность 7811 ед, удельная активность — 11 ед/мг белка, Митохондрии,, очищенные от миелина и синаптосом, суспендируют в

0,01М фосфатном буфере рН 7,4 и разрушают в гомогениэаторе типа Блендор при 13000 об./мин. Полученный гомогенат центрифугируют при

150000 8 в течение 60 мин для полного освобождения раствора ст митсхондриальных мембран. Супернатант отделяют от Осадка, его общий бе лок 286 мг, общая активность

6581 ед, удельная активность

23 ед/мг белка. Доводят рН супернатанта до 5,9 О,IN соляной кислотой и центрифугируют при 10000 g в течение 10 мин. Общий белок полученного супернатанта, 115,2 мг, общая активность 3918 ед, удельная активность 34.ед/мг белка.

Супернатант пропускают через стеклянную колонку, заполненную катионитом "Биокарб" (внутренний диаметр колонки 1,7 см, объем сорбента 4,09 см ), со скоростью

88 мл/ч. По окончании сорбции колонку промывают водой до исчезновения белка в промывных водах (контроль на белок осуществляют спектрофотометрическим методом по оптической плотности раствора при длине волны

280 и 260 нм) .

Десорбцию проводят ступенчатым градиентом рН тремя 0,1 М фосфатными буферами с рН 5,9; 6,3 и 6,8. Скорость дессрбции 44 мп/ч. Сначала пропускают 50 мл буфера с рН 5,9, затем

50 мл с рН 6,3 и наконец 120 мл с рН 6,8, На выходе из колонки отбираются фракции по 15 мл, в которых определяются рН, концентрация белка (спектрофотометрическим методом и по методу Лаури) и активность малатдегидрогеназы (спектрофотометрическим методом), фракции с удельной активностью выше 1000 ед объединяют. Объем активных фракций

76 мл, общий белок 1,23 мг, общая активность 3087,3 ед удельная активность 2510 ед/мг белка.

Пример 2. Получают митохондрии иэ головного мозга по методу

Фонье и Шомодьи. Общий белок

4640 мг, общая активность 26912 ед, удельная активность 5,8 ед/мг белка. Фракциы млтохсндрий суспендируют 0,7М раствором сахарозы

28386 ед, удельная активность

5,7 ед/мг белка. Митохондрии суспендируют в 0,7 М сахарозе и центрифугируют в градиенте плотности сахарозы (0,7:1,2:1,5 М) при

60000 g в течение 2 ч. Осадок представляет собой обогащенную митохондриальную фракцию, очищенную от миелина и синаптосом. Общий белок

723 мг, общая активность 7953 ед, удельная активность 11 ед/мг белка. Очищенные митохондрии суспендируют в 0,01 М фосфатном буфере рН 7,4 и разрушают в гомогенизаторе типа Блендор при

13000 об./мин в течении 5 мин. Гомогенат центрифугируют при 150000 g в течение 60 мин для осаждения митохондриальных мембран, в дальнейшем работают с супернатантом.

Общий белок 281 мг, общая активность 5901 ед, удельная активность

2l ед/мг белка. Доводят рН супернатанта до 6 1 0 1Н соляной кислотой и центрифугируют при 10000 g в течение 10 мин. Общий белок полученного супернанта 123 мг, общая активность 4059 ед, удельная активность 33 ед/мг белка.

Супернатант пропускают через колонку, заполненную сорбентом

"Биокарб" (внутренний диаметр колонки 1,7 см, объем сорбента 4 см) со скоростью 88 мп/ч. По окончании сорбции колонку промывают водой до исчезновения в промывных водах белка (контроль на белок осуществляют спектрофотометрическим методом по оптической плотности раствора при длине волны 280 и 260 нм).

Десорбцию проводят ступенчатым градиентом рН тремя О,IМ фосфатными буферами: с рН 6,2; 6,7; 7 ° 2.

Скорость десорбции 44 мп/ч . Сначала пропускают 50 мл буфера с рН 6,2, затем 50 мп с рН 6,7 и наконец

75 мл с рН 7,2. На выходе из колонки собирают фракции по 15 мп, в которых определяют рН, концентрацию белка (спектрофотометрическим методом и по методу Лоури) и малатдегидрогеназную активность (спектрофотомет-. рическим методом). Фракции с удельной активностью выше чем 1000 ед/мг белка объединяют, их объем 60 мл.

Общий белок 1,22 мг, общая активность 2908 ед.,удельная активность

2384 ед/мг белка.

3 1165402 (рН 7,4) до концентрации 18 мг/мп и центрифугируют в градиенте плотности сахарозы (0,7:1,2:1,5M) при

60000 g в течение 2 ч. Осадок представляет собой митохондриальную фракцию, очищенную от миелина и синаптосом. Общий белок 705 мг, общая активность 8 460 ед, удельная активность 12 ед/мг белка. Очищенные митохондрии суспендируют в !О

0,01 М фосфатном буфере 7,4 и разрушают в гомогенизаторе типа Блендор при 13000 об./мин. Гомогенат центрифугируют при 150000 g в течение 60 мин для полного осаждения митохондриальных мембран. Супернатант отделяют, его общий белок

275 мг, общая активность 6,325 ед, удельная активность 23 ед/мг белка, Доводят рН супернатанта до 6,0 О,IH соляной кислотой и центрифугируют при 10000 g a течение

10 мин для осаждения выпавших в осадок белков. Общий белок полученного супернатанта 118,6 мг, общая активность 3 795 ед, удельная активность 32 ед/нг белка.

Супернатант пропускают через колонку, заполненную сорбентом "Биокарб" (внутренний диаметр колонки

1,7 см, объем сорбента 3,9 см5), со скоростью 88 мл/ч. По окончании сорбции колонку промывают водой до исчезновения в промывных водах белка (контроль на белок осуществляют спектрометрическим методом).

Десорбцию проводят ступенчатым градиентом рН тремя О,IМ фосфатными буферами с PH 6,0; 6 5 и 7,0, скорость десорбции 44 мп/ч. Сначала пропускают 50 мл буфера с рН 6,0, затем 50 мл с рН 6,5 и наконец

90 мл с рН 7,0. На выходе из колонки отбирают фракции элюата по 15 мл, в которых определяют рН, концентрацию белка (спектрофотометрическим методом и по методу Лоури) и активность малатдегидрогеназы (спектрофотометриыеским методом). Фракции с удельной активностью 1000 ед/мг белка и выше объединяют. Общий белок 1,22 мг, общая активность

3080 ед, удельная активность

2524 ед/мг белка.

Пример 3. Митохондрии из головного мозга быка получают по методу Фоиье и Шомодьи. Общий белок 4980 мг, общая активность

165402

Составитель 3,Цыганков

Техред Ж. Кастелевич

Редактор О.Юрковецкая

Корректор В.Гирняк

Заказ 4258/8 Тираж 722

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д .4/»

Подписное

Филиал ППП "Патент", г.ужгород, ул.Проектная, 4

Активность малатдегидрогеназы определяют спектрофотометрическим методом по изменению концентрации

НАДН в 1 см кювете при длине волны 340 нм. Исследована реакция окисления НАДН при рН среды 7,4. 3а единицу активности принято количество фермента, необходимое для окисления

10 моль НАДН в 1 мин.

Полученный препарат не содержит посторонних дегидрогеназных активностей (глютаматдегидрогеназной, лактатдегидрогеназной), Проведенный электрофоретический анализ преб парата на гомогенность раствора показывает наличие в растворе двух белков, один из которых идентифицирован как малатдегидрогеназа.

Продолжительность опыта с момента получения мозпа до получения фермента 3-4 дня, собственно на очистку фермента необходимо 9-11 ч, Таким образом, предлагаемый спо-!

О соб высоко надежен, прост в исполнении, не требует дорогостоящего оборудования и реактивов, позволяет получать фермент с удельной активностью

2400-2550 ед/мг белка,