Способ количественного определения проросших спор бактерий

 

1.СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПРОРОСШХ СПОР БАКТЕРШ1 путем активации суспензии спор с последующим инкубированием в присутствии инициатора прорастания и определением состояния спор до и после инициации, отличающийс я тем, 4TOj с целью повышения точности способа при исследовании суспензий спор Bacillus thuringiensis, содержащих светорассеивающие примеси , до и после инициации определяют дегидрoreназную активность спор и количество проросших спор определяют по разности величин ферментатИв .ных активностей. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что дегидрогеназсл ную активность определяют флуориметрическим методом с использованием резазурина или.спектрофотометрическим с использованием соли тетразолия . 4 00 ч1 00

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (19) (11) 1

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3712639/28-14 (22) 20.03.84 (46) 30.11.85. Бюл. 11- 44 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт биологического приборостроения (72) В.Х.Тихонов, А.Н.Мезенцев, В.Л.Земляков, А.Н.Алексеев, В.В.Шевцов и В.В.Федченко (53) 576.8,093.1(088.8) (56) Месробяну Л., Пэунеску Э.. Физиология бактерий. Бухарест, Меридиане, !963, с.!17-125.

Powell J.F. J.Gen. Microbiology, 4, !1- 3, 1950, р. 330. ,Powe}l J. F. J. Gen. Microbiology, 5, 9 5, р. 993, 1951. (54) (57)! . СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО

ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПРОРОСШИХ СПОР БАКТЕРИЙ путем активации суспензин спор с по15Р .С 12 И 1/00, С 12 Ц, 1/00

-1(С 12 N 1/00, С 12 R 1:07) следующим инкубированием в присутствии инициатора прорастания и определением состояния спор до и после инициации, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повышения точности способа при исследовании суспензий спор Bacillus thuringiensis, содержащих светорассеивающие примеси, до и после инициации определяют дегидрогеназную активность спор и количество проросших спор определяют по разности величин ферментатив.ных активностей.

2. Способ по п.1, о т л и ч а— ю шийся тем, что дегидрогеназную активность определяют флуориметрическим методом с использованием резазурина.или снектрофотометрическим с использованием соли тетразолия.

Пример 2. 4,0 мл суспензии энтобактерлна (препарат У 2) на физиологическом растворе (0,5X NaC1), содержащей 44 мг сухого препарата в мл, прогревают при 75ОС в течение

5 мин, затем разливают в .две пробирки по 1,6 мл прогретой суспензии. В первую пробирку добавляют

0,4 мл дистиллированной воды, а во !

0 вторую — 0,2 мл водного раствора аденозина (0,01 И) и 0,2 мл водного раствора f-аланина (0,05 М). Вторую пробирку инкубируют при 30 С в течение 30 мин. Затем в обе пробирки добавляют по 0,5 мл раствора метилтиаэолилтетраэолия бромистого, инкубируют при 42 С в течение 15 мин, добавляют в них по 2 мл 96Х-ного этанола, встряхивают смесь, фильтруют ее через бумажный фильтр, промывают фильтр 2 мл 967.-ного этанола и измеряют оптическую плотность объе/ диненных спиртовых экстрактов при .

560 и 700 нм. Получают величины

25 оптической плотности на этих длинах волн 0,13 и 0,10 соответственно для первой пробирки и 0,59 и 0,13 для второй. Прирост величины оптической плотности при инициации равен

30 (0,59 0 13) (0,!3-0,10) = 0,43 и по калибровочному графику находят концентрацию живых прорастающих споровых клеток в первоначальной суспензии препарата, равную

3,6"10 кл/мл, а затем рассчитывают

35 содержание клеток в сухом препарате. 3,6 10 кл.: 0,044 r =

8,1 ° 10 кл./r.

Время проведения анализа — 0,51 ч. Сравнительные данные по точности

40 определения приведены в таблице.

1 1194873

Изобретение относится к микробиологической промышленности и может быть использовано для контроля бактпрепаратов, в частности энтобактерина.

Цель изобретения — повышение точности способа при исследовании суспензий спор Bacillus thuringiensis, содержащих светорассеивающие при.меси.

Пример 1. 4 мл суспенэии энтобактерина (препарат У 1) в

1/15 М фосфатном буфере pH= 6,5, содержащей 12 мг сухого препарата в о мл, прогревают при 75 С в течение

5 мин (активация прорастания) затем разливают в 2 пробирки по 1,5 мл прогретой суспензии. В первую пробирку добавляют 0,4 мл дистиллированной воды, а во вторую — по

2 мл водных растворов аденозина (0,01 М) и 0-аланина (0,05 М). Вто рую пробирку инкубирают при 30 С в течение 30 мин (инициация прора- стания). Затем в обе пробирки добавляют по 0,1 мл раствора резазурина (0,6 M), инкубируют при 45 С в течение 10 мин и определяют величины фпуоресценции проб при 580 нм на спектрофлуориметре. Величина флуоресценции первой пробы равна

9 единицам, а второй — 95 единицам, прирост флуоресценции — 86 единиц. По калибровочному графику находят концентрацию живых прорастаю- . щих споровых клеток в первоначальной суспензии препарата, .равную

7,6 10 кл/мл, а затем рассчитывач ют содержание клеток в сухом препарате: 7,6 10 кл.: 0,012

* 6,3.10 кл./г.

1194873

iочность определения количества прорастающих спор бактерий двумя способами, предлагаемым и прототипом

М препарата энтобактерина

6,9

230

5,1

11О

3,5

П р и м е ч а н и е: стандартное отклонение вычислялось из данных

10 измерений каждого препарата обоими способами.

Составитель Г. Смирнова

Техред М.Гергель Корректор М.Самборская

Редактор Ю.Середа

Заказ 7380/29 Тираж 524 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5 с)

Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4

Стандартное отклонение при определении предлагаемым способом, флуориметрический вариант, 7

Стандартное отклонение, при определении способом-прототипом (по изменению светорассеяния образца), 7