Способ выделения эндонуклеазы из яда кобры

 

„„SU„„1203902,А 1

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК щ)5 С 12 N 9/22, А 61 К 35/58

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ и «3 k « 4 - .". „,, - Б;.:: :,,j

«

К ASTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Г"ОСУДАРСТВЕНКЫЙ КОМИТЕТ

rlO ИЭОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 3627615/28-14

:(22) 26.07.83 (46) 30.11.90. Бюл. 11 44 (71) Опытный завод, органического син« теза и биопрепаратов Института химии

АН ЭССР и Институт химической и биологической физики АН ЭССР (72) А.А. Таре ° В.Ю.Ярве, Ю.P. Сийгур и В. А. Аавиксаар (53) 577.155.2 (088.8) (56) Василенко С.К., Райт В.К. Метод выделения высокоочнщенной рибонуклеазы из яда среднеазиатской кобры. Биохимия, 1975, 40, вйп. 3, с. 578-583- . (54)(57) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ЭНДОНУКЛЕА ЗЫ ИЗ ЯДА КОБРЫ, включающий растворение яда в буферном растворе с послеИзобретение относится к биохимии.

Целью изобретения является упрощение способа, повышение выхода и степени очистки, Способ осуществляют следунщим об.разом.

Яд кобры растворяют в растворе

0,19-0,21 И уксуснокислого аммония с удельной электропроводностью (14,515,5) < 10 S-см, рН 6,4-6,6, центрифугируют при 5000 об/мин, осадок выбрасывают, надсадочную жидкость используют дпя гельфильтрации. Гельфильтрацию проводят на сефадексе Г-50 тонкий, с 0,19-0,21 М раствором уксуснокислого аммония с удельной электропроводиостью (14,5-15,5) ° 1(Г $ см, рН 6,46,6. Полученную фракцию эндонуклеаэы: при рН 7,7-7 ° 9 наносят на колонку ДНКагарозы, Основная часть белка прохо2 дукщим центрифугированием, гельфильтрацией надсадочной жидкости на сефадексе и хроматографией с элюцией фермента солевым раствором, о т.л и ч аю шийся тем, что, с целью упрощения способа, повышения выхода и степени очистки, растворение яда и гельфильтрацию осуществляют в О, 19-0,21 М растворе уксуснокислого аммония с рН

6,4-6,6, в полученном после гельфнльтрации растворе устанавливают рН 7,77,9 и хроматографию проводят на ДНКагарозе с использованием в качестве элюирукщего раствора уксуснокислого аммония с градиентом рН от 7,7-7,9 до

4,9-5,1 и ионной силы от О, 19-0,21 до

0,95-10,5, а затем лиофильно высушиваютт. дит аффинную колонку, а эндонуклеаза при рН 7,7-7,9 и удельной электропро водности раствора (14,5-15,5) ° 10 З

Я см" (0,19-0,21 М уксуснокислого аммония) прочно связывается на афинном сорбенте. Эндонуклеазу элюируют линейным градиентом ионной силы и рН раствора уксуснокислого аммония от (0,19-0,21) до 0,95-1,05 M с удельной электропроводностью от (14,5-15 5)

-3

° °

kl0 до (63-65) 10 см 1, изменение рН от 7,7-7,9 до 4,9-5,1. Фракции эндонуклеазы собирают и высушивают лиофкпьно. Выход 80Х. Степень очистки—

250 раэ, Пример. К !9,7 г яда кобры добавляют 150 мп раствора 0,19 М уксуснокислого аммония с удельной элек- тропроводностью 14 5-10" S-см ", рН

6,4, смесь медленно перемешивают в

1203902

Редактор О. Филиппова Техред M.Moðãåaòàë

Корректор M.Пожо

Заказ 4342 Тираж 494 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Рауаская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.Ужгород, ул. Гагарина, 101 течение 4 ч .при +4 С. Растворенный яд центрифугируют при 5000 об/мин при .+4оС в. течение 30 мин, Осадок выбрасывают, надосадочную жидкость используют для гельфильтрации. На уравно" веаенную 0,19 М раствором уксуснокислого аммония (удельная электропроводность 14,5 ° 10 S см ) колонку с сефадексом -50 тонким размеры колон- 10

;ки 111110 см наносят раствор ядра.. ! Колонку элюируют О, 19 М раствором уксуснокислого аммония с удельной электропроводностью 14 5 10 Я см, рН 6,4 со скоростью 180 ма/ч и соби- 15 рают фракции по 30 мп. Оптическую ппотность. элюата регистрируют непрено с помощью нувикорд l lii Получают 5 белковых пиков. В l l пике фракции, которые имеют активность sago- 20 нуклеазы, объединяют (объем 930 мл), Раствор эндонукпеазы, при рН 7,7 наносят на ксщонку ДНК-агарозы, уравновеаениую 0,19 М раствором уксусно-". кислаго аммония с удельной электропро-25 водностью 14,5-10 S см, рН:7,7. Че- рез колонку пропускают 1,0 л раствора

0,19 М уксуснокислого аммония с рН

7,7 (удельная электропроводность раствора )4,5 ° 10 Зсм ). Скорость элюций

10 мп/ч, собирают фракции по 15 мп.

Оптическую плотность элюата регистрируап непрерывно с помощью "Увикорда".

Основная часть белка в данных условиях проходит аффинную колонку, а эндо нуклеаза, имеющая оптимум активности, при рН 7,.8 связывается на ДНК-агаро-, зу и ее элюируют градиентом ионной силы и рН раствора уксуснокислого аммо ния, концентрация уксуснокислого ам мония от 0,19 М с удельной электро:проводностью 14,5 10 S-.ñì до 0,95 М с удельной электропроводносты4

63 !О" $ см рН от 7,7 до 4,9. Фрак» ции, содержащие эндонукпеазную актив- ность, объединяют, выход 156 мн и вы» суживают лиофильно.

Характеристика препарата: выход

80,3Х степень очистки - 254 раза, I