Способ получения сорбента для аффинной хроматографии

 

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (19) (11) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМ,Ф СВИДЕТЕЛЬСТВУ (54)(57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СОРБЕНТА

ДЛЯ АФФИННОЙ ХРОМАТОГРАФИИ путем обработки силохрома с привитыми аминопропильными группами модификатором — производным бензохинона, отличающийся тем, что, с целью обесгечения селективности сорбента к менадионредуктазе, s качестве модификатора используют

4,5-диметокси-1,2-бензохинон.

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3735369/23-26 (22) 11.03.84 (46) 15.03.86. Бюл. и 10 (71) Белорусский научно-исследовательский институт неврологии, нейрохирургии и физиотерапии (72) 3.П.Титовец и Ж.Л.Щербинская (53) 543;544 (088.8) (56) Авторское свидетельство СССР

У 762916, кл. В 01 D 15/08, 1980.

Авторское свидетельство СССР

У 942427, кл. С 12 N 9/50, 1978. (5D 4 В 01 1 20/10, С 01 N 30/48;

В 01 D 15/08

В(;гГ(1 - "1217461 2

Изобретение относится к энзимоло гии, аналитической биохимии, в частности к способу получения сорбентов для аффинной хроматографии менадионредуктазы.

Цель изобретения — обеспечение селективности сорбента к менадионредуктазе.

Способ получения модифицированно-, го пористого аминосилохрома, содержащего на поверхности группу заключается в том, что силохром аминопропиловый подвергают взаимодействию с 4,5-диметокси-1,2-бензохиноном, взятом в избытке по отношению к аминогруппам носителя, в водноорганической среде при рН 7,2-7,5, Процесс получения сорбента, можно представить следующей схемой

Модифицированный 4-N-5-метокси1, 2- б е нз охи но ном п ори с тый ами носило1 ром несет ковалентно связанный лиганд со структурой аминохинона, который является субстратом менадионредуктазы. Данный хинон специфически взаимодействует с менадионредуктазой с образованием ферментсубстратного комплекса, что обеспечивает высокую избирательную сорбцию фермента из смеси белков.

Пример 1. Для синтеза сорбента используют силохром аминопропиловый (квалификация ч), который предварительно просеивают через сита для получения однородных частиц с диаметром 0,1-0,2 мм.

55 нзсо о

-(СНА NH О

СИЛО РЛН (cH ) нн + 3

HC 0 — ь анинспрспикцй з н СО 0 ситрри анилолропилпдрй =.) (сн )эмн ъг .0

45 r. аминосилохрома (617 мкмоль аминогрупп на 1 r) промывают 400 мп дистиллированной воды, 200 мл 0,1 M боратного буфера, рН 8,0; 200 мп

О, 1 M ацетатного буфера, рН 4,0, на стеклянном фильтре под вакуумом, создаваемым водоструйным насосом.

Промытый силохром переносят в колб5, содержащую 600 мг 4,5-диметокси-1,2-бензохинона в ?О мм диметилсульфоксида и 30 мл 0,07 M фосфат— ного буфера, рН 7,3.

Суспензию выдерживают при постоо янном перемешивании 60 ч при 22 С.

Полученный продукт промывают от несвязавшегося бензохинона 100 мл раствора диметилсульфоксида, 300 мп

О, 1 М боратного буфера, рН 8,0;

300 мп 0,1 М ацетатного буфера, рН 4,0, 300 мл дистиллированной воды.

Пример 2 ° Препарат менадионредуктазы представляет собой белковую фракцию гомогената из печени

15 крыс., содержащуюся в интервале 60807 насыщения сульфатом аммония с удельной. активностью 4, 7 мкмоль/мин мг

Активность менадионредуктазы определяют по скорости восстановления

2,6-дихлорфенолиндофенсла в присутствии ИАДН при 600 нм.

Сорбент, полученный по примеру упаковывают в колонку высотой 2,5 см и диаметром 1,5 см и уравновешивают

0,07 M фосфатным буфером с рН ?,5. . На колонку наносят 2 мп исходного препарата менадионредуктазы, пропускают 30 мл 0,07 M фосфатного буфера, рН 7,5, с 0,5 M NaCf. После отмывки от несвязавшегося белка через колонку пропускают 25 мл 307 этиленгликоля в 0,07 М фосфатном буфере, рН

7,5, содержащего 0,5 M NaC f. В элюате определяют активность менадион-редуктазы. Удельная активность очи-. щенного фермента составляет

436 мкмоль/мин мг.

Выход фермента 687, очистка менадионредуктазы в 93 раза.

Пример 3. Использование сорбента для аффинной хроматографии препарата менадионредуктазы, полученного из гомогената печени крыс после изоэлектрического осаждения примесных белков при рН 5,0.

Исходный неочищенный препарат менадионредуктазы с удельной активностью 2,8 мкмоль/мин мг B количестве 5 мп наносят на колонку вы— сотой 8,7 см и диаметром 1,5 см, упакованную сорбентом, полученном но примеру 1. Остальные условия эксперимента по примеру 2. Удельная активность очищенной менадионредуктазы составляет 224 мкмоль/мин мг.

Выход фермента 607. со степенью очистки в 80 раз.

1217461

Составитель С. Староверов

Редактор Н.Воловик ТехредМ.Гергель Корректор Л.Патай

Заказ 1029/10 Тираж 527 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д.4/5

Филиал ППП "Патент", г.Ужгород, ул.Проектная,4

Предлагаемый способ позволяет в одну стадию получить аффинный сорбент, йзбирательно связывающий менадионредуктазу и обеспечи. вающий ее выделение из смеси белков.