Способ определения осмотических свойств клеточных мембран

 

Изобретение относится к исследованию вещества методом ЯМР и может быть использовано для контроля осмотических свойств клеточных и везикулярных мембран, а также полупроницаемых замкнутых оболочек. Цель изобретения - расширение функциональных возможностей способа и сокращение времени анализа . Сущность способа заключается в следующем. Измеряют амплитуду сигнала ЯМР от протонов воды образца суспензии клеток в исходном состоянии, переводят клетки этого образца с сохранением их количества из исходного состояния в исследуемое, добавляют во внеклеточный объем парамагнитное вещество низкой концентрации и измеряют среднее время жизни молекул воды в клетках и амплитуду сигнала ЯМР от протонов внутриклеточной воды. Далее аналогичные операции проделывают для серии исследуемых образцов. сл ND ГО 4 05 СО со

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛ ИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН (51) 4 С 01 Н 24/08

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

И ABTOPCHOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ (72) В.Г.Рыжов, В.Я.Волков и Ф.Ш.Иоангалин (53) 539.143.43(088.8) ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 3769288/24-25 (22) 06.07.84 (46) 15.04.86. Бюл. У 14 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт прикладной микробиологии (56) Conton T. Outhred R. Woder diffusion permeability of erythrocytes

using à nuclear magnetigne resonance technigue. — Biochim, Biophys.

Acta, 1972, ч. 288, р. 354-36).

Small W.Ñ., Goldstein J.Н. The

effect of ohanging ехсгасеЙиГат osmotafity on water transport in the

human red bLood cef.Ãàs measured by

the cef.1 water recidence time and

the activation energy of water transport. — Biochim., Biophys. Acta, 1981, v. 640, р. 430-438.

„„SU„, 1224693 А (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОСМОТИЧЕСКИХ

СВОЙСТВ КЛЕТОЧНЫХ МЕМБРАН (57) Изобретение относится к исследованию вещества методом ЯМР и может быть использовано для контроля осмотических свойств клеточных и везикулярных мембран, а также полупроницаемых замкнутых оболочек. Цель изобретения— расширение функциональных возможностей способа и сокращение времени анализа. Сущность способа заключается в следующем. Измеряют амплитуду сигнала

ЯМР от протонов воды образца суспенэии клеток в исходном состоянии, переводят клетки этого образца с сохранением их количества из исходного со- ® стояния в исследуемое, добавляют во внеклеточный объем парамагнитное вещество низкой концентрации и измеряют среднее время жизни молекул воды в

12 клетках и амплитуду сигнала ЯМР от е протонов внутриклеточной воды. Далее аналогичные операции проделывают © для серии исследуемых образцов.

12246

Изобретение относится к физическим методам исследования вещества на основе явления ядерного магнитного резонанса и может быть использовано в микробиологической и пищевой

5 промышленности, медицине, биологии и других областях естественных наук, где необходимо проводить быстрый и точный контроль осмотических свойств клеточных и везикулярных мемб-!0 ран, а также полупроницаемых замкнутых оболочек.

Цель изобретения — расширение функциональных возможностей способа и сокращение времени анализа.

Сущность способа заключается в следующем.

Измеряют амплитуду сигнала ЯМР от протонов воды М „ образца суспензии клеток в исходном состоянии (при исходной осмоляльности внеклеточной среды) и одном выбранном значении температуры, переводят клетки этого образца с сохранением их количества из исходного состояния в исследуемое (к исследуемой осмоляльности внеклеточной среды), добавляют во внеклеточный объем парамагнитное вещество низкой концентрации (5

7 ммоль) и измеряют в этом состоянии при одном выбранном значении температуры среднее время жизни молекул воды в клетках и амплитуду сигна.ла ЯМР от протонов внутриклеточной воды М

Далее аналогичные операции проделывают для серии иэ исследуемых значений внеклеточной осмоляльности.

Таким образом, в предлагаемом способе исключается операция измерения

4 40 температурной зависимости L при каждом значении исследуемой внеклеточной осмоляльности, что значительно сокращает затраты времени. Если количество клеток во всех исследуемых

45 состояниях одинаковое, то отношение

М„./И„ = 1 для всех i = 0,1,...,N, где Й . и И вЂ” амплитуды сигналов

hi ь

ЯИР н одном из исследуемых и исходном состояниях образца. По измеренным значениям и И „; и И„и изб 50 вестным формулам оценивают изменения внутриклеточного объема V, образца и определяют диффузионную водную проницаемость (ДВП) клеточных мембран.

Способ осуществляют следующим об55 разом.

Часть исходной суспензии клеток (объемом = 0,1 — 0,2 мл) помещают в

93 2

AMP-àìïóëó, измеряют амплитуду И, сигнала ЯМГ от протонов воды. Затем клетки образца пере.бдят в одно иэ исследуемых состояний при добавлении парамагнитного вещества в таком количестве, чтобы его концентрация во внеклеточном растворе не превышала

5-7 ммоль. Измеряют по точкам кривую спада поперечной намагниченности

М,, которую можно разложить на сумму

1 трех экспонент с параметрами: Т ( с т

М, Т, И и Т с, Н, где М,, М, 11 — амплитуды отдельных ком( понент соответственно, а Т вЂ” длинt f ное Т, — короткое Т промежу точное время поперечной релаксации.

Первая группа параметров (Т,, М, ) относится к протонам внутриклеточных структур и мембран клетки, т,е. ! к твердому телу, поэтому Т значительно короче времени Т и Т каждая иэ двух остальных компонент характеризует протоны внутри- н внеклеточной воды.

Дапее при том же исследуемом значении внеклеточной осмоляльности готовят образец для измерения в нем времени релаксации протонов внутриклеточной Т или внеклеточной Т 2. а воды. Используя значения Т, И а а

Т !< и Tй нли Т и выражения для двухфазной системы ядерных спи— нов с обменом намагниченности между фазами, определяют одновременно среднее время жизни молекул воды в клети ках и OTBocHTeJlbHoe количество (долю) внутриклеточной воды Р для а каждого исследуемого состояния образца.

Амплитуду Й сигнала ЯМР, соответствующую протонам внутриклеточной воды в исследуемом состоянии образца, определяют из соотношения И

= Р, (И + И ). Далее проделывают такие же операции для каждого значения исследуемой внеклеточной осмоляльности. Исходное состояние образца принимают за контрольное.

1Io измеренным значениям амплитуд сигналов и по известным формулам оценивают изменения внутриклеточного объема V; исследуемых состояний, а затем определяют диффузионную водную проницаемость клеточных мембран по отношению к исходному состоянию образца.

Пример. Определение относительных значений количества внутриклеточной воды и диффузионной водной

1224693 проницаемости эритроцитарных мембран от величины осмоляльности внеклеточной среды, создаваемой хлористым натрием, при + 5 С, Кровь объемом по = 0,1 — 0,2 л разливают в две П!Р-ампулы (1 и ), измеряют амплитуду М = 11,7 + 0,1 сигнала поперечной намагниченности

М, протонов воды в образце 1. Амплитуда сигнала ЯИР измерена в условных единицах. Затем к образцам 1 ! и 1 добавляют по 3 мл водного раствора хлористого натрия, например, осмоляльностью П = 0,28 осм. В образец 1 добавляют дополнительно

25 мкл водного раствора !!пСГ исг ходной концентрации 0,5 моль с целью, чтобы его конечная концентрация была менее 5 ммоль. Образцы выдерживают в солевом растворе 30 мин. Затем эритроциты образца 1 осаждают =1 мин при 1600 g (g = 9,8 м/с ), супернатант отбирают в таком количестве, чтобы объем оставшейся суспензии был равен = 0,1 — 0,2 мл. Эритроциты образца 1 осаждают 40 мин при

1600 g, супернатант полностью отбирают.

Методом Карра — Парселла-Мейбума-! илла (KIIMI) измеряют время спинспиновой релаксации Т = 76,9 + 2 мс протонов внутриклеточной воды в плот| ноосажденных эритроцитах образца 1 и тем же методом — параметры кривой

М (Т = 24,1 + 0,5 мс, М = 3,57 +

+ 0,03, Т = 2,44 + 0,06 мс, И =

6,28 + 0,06, Т,= 0,43 + 0,01 мс, М = 0,91 + 0,0!) "успензии эритроцитов образца 1. Соответствующая протонам гемоглобина и мембран компонен-! та (Т, И ) спада И, в расчетах не учитывается.

1 I

На основе параметров Тг, Т, И „, МЮ, Т2 вычисляют одновре енно сред2а !! нее время жизни молекул воды | в клетке и долю внутриклеточной воды Р в суспензии клеток образца 1. Эти величины равны . = 33,8 + 0,8 мс, Р

= 0,313 + 0,005. Находят амплитуду протонов внутриклеточной воды Ма =

= Р„(М„+ 11.) = 3,08 + 0,05. Таким же образом определяют аналогичные параметры образцов с разным осмоти; ческим давлением внеклеточной среды и по известным формулам — относительные величины количества внутриклеточной воды и ДВП эритроцитарных мембран в i-м исследуемом состоянии образца относительно его исходного состояния, за которое принята осмоляльность П = 0,28 осм внеклеточного раствора хлористого натрия, близкая к изотонической осмоляльности плазмы крови. Изменение коли1р чества внутриклеточной воды в эритроцитах в координатах Вант-Гоффа (V

| -П ) описывается линейной зависимостью с коэффициентом наклона К = 0,246.

Таким образом, в исследуемой области осмоляльностей эритроцитарная мембрана проявляет идеально упругие свойства, т.е. ведет себя как идеальный осмометр. ДВП эритроцитарной мембраны остается постоянной вблизи иэотонической точки и возрастает с увеличением и уменьшением осмоляльности внеклеточной среды. Следовательно, энергетический барьер для

2 трансляционной диффузии молекул воды через эритроцитарную мембрану минимален вблизи изотонической осмоляльности.

Ф о р м у л а и з о б р е т е н и я

Способ определения осмотических свойств клеточных мембран, включающий измерение среднего времени ьа жизни молекул воды в клетКах образца мето35 дом ядерного магнитного резонанса ! (Я!!Р) с добавлением во внеклеточный объем образца парамагнитного вещества низкой концентрации, о т л и ч а4р ю шийся тем что с целью рас ширения функ-иональных воэможностей и сокращения времени анализа, измеряют отношения началъных амплиту | сигналов ЯИР от протонов внутриклеточной воды образца в исходном и исследуемых состояниях, получаемых при добавлении нескольких порций парамагнитного вещества, по измеренным отношениям судят об изменениях внутриклеточного объема V исследуел состояний и по значениям |а

V определяют диффузионную водную проницаемость клеточных мембран но отношению к исходному состоянию образца.