Н AATEHTV (21) 3437 277 /23-04 (62) 3350453/23-04 (22) 18.05.82 (23) 03.11.81 (31) 2649/80 (32) 04.11.80 (33) HU (46) 15.04.86. Бюл. № 14 (71) Хиноин Дьедьсер еш Ведьесети

Термекек Дьяра РТ (eU) (72) Илона Элекеш, Ласло Инштиториш, Кальман Медзихрадски, Ласло Етвеш, Хедвиг Медзихрадски, Каталин ди Глериа, Янош Шугар, Жужанна Шомфаи-Релле, Шандор Экхардт, Иван Хиди и Шандор Керпель-Фрониуш (HU) (53) 547.717.07(088.8) (56) Патент Великобритании № 1490649, кл. С 2 С, опублик. 1977.

Бюлер К., Пирсон Д. Органические синтезы. M.: Мир, 1973, ч. 2, с. 290-292. (54) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ 1,2-5,6вЂ” ДИАНГИДРО вЂ” 3, 4-БИС вЂ” (f-КАРБОКСИПРОПИОНИЛ)-ДУЛЬЦИТА ИЛИ ЕГО ДИНАТРИЕВОЙ

СОЛИ, о т л и ч а ю «ц и и с я тем, что 1,2-5,6-диангидродульцит подвергают взаимодействию с ангидридом янтарной кислоты в сухом этилацетате в присутствии пиридина при 45 С, целевой продукт выделяют в свободном или в виде динатриевой соли.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ «g "-:- Ф,. / й®д@-„„.. /

1225487

1с (: JГ:(тепие Относится к cl(oc(ráу г, > -", . (,я н 1вых химических биоJIoгич.:сьп -::.-.тив ых соединений,, конкретно к сис собу г олучения новых произ водных ): iгидгодульцитa вЂ” 1,2-5,6-диаиг! Н1, -: вЂ”.", 4-бис- (p-êBpáoêcHïðor!HoíHJI)вЂ” дул(цпта или его динатриевой соли, обладающих слособностьюингибировать

-ра -;IJ!! Tr;(злокачественных Опухолей.

Цел-,вЂ”, изобретения вЂ” получение новь(х;роиэ;,o;IIIbrr ряда 1,2-5,6-диангипродульцит;., обладающих более высоким -:ерeïebiòrr÷ecêêì индексом при более ":якой токсичности.

П р им е р 1, 1946 г (10ммо,пь)

1,2--5 „6--диан идродульцита рас.творяют

1 в 20 ";;,. сухого этилацетата добавпяют к рис:твору 5 мл пиридина, а затем к смес -: малыми порциями добавляют

2,0 -. (20 ммоль) янтарного ангидрида при постоянном перемешивании. Смесь подогревают до 45 С и перемеи(ивают пр91 эоой Tеыпературе в течение еще

8 -;. Гас"!.âîpнтель дистиллируют в вакуу((О9 остаток отбирают в смеси этилапетата и воды, полученную смесь осто ожно подкисляют, охлаждася льдом, до р1- «--5. Органическую фазу отцеляют про (ь1вают водой, высушивают и выПолyL!BroT 2,5 о ."та к;.;„ который соответствуь.т коли-..cт 1ениому выходу, рассчитанному для моносукцинил-диангидродульцита.

I1(Jay«e!!roе сырое вещество подвергаю .(00: атографированию на колонке с с(ипи .Огелсм, используя смесь (1:1, o з ем/объем) метанола и этилацетата в канис.тве элюирующего агента. Фраки:-и,„ содержащие чистые продукты, перемеш .Нают, раствор выпаривают в вакууме.. Полученный твердый продукт .(Од« ргают перекристаллизации из с ((:(::, иэтилового эфира и петролейНОГс =-фИРа9 а ЗатЕМ ИЗ СМЕСИ МЕТаНО.ла ." диэтилового эфира. ПОлучают

1, с . i 92--5,6-циангидро"3,4-бисвЂ(I9-карооксипропионил) вЂ” дульцита.

Вь(числено, %: С 48,78; Н 5,73;

0 45. 49.

Н 0„;, (346, 29)

Наидеr<(o-. % С 48,35; H 5 92э, 0 46,60.

Зквивале::::тная масса, вычислено

173, найденс 180. II< c пек r p: 3350 c! I " (карбоксипь:.ая группа), 1235 см (эпокси), бел,ил-.вЂ” пые и гидроксипьные нопосы !Ie с биарус(еп(ы, Растг 019и;.(Ос Ti;, соединение корок(о растворяется в с!IHpte и т тра-.идрофуране и с fa6u pic T13npHMA R диэ тило вом эфи1эе и вод(..

Пример 2,. Пол, пение дин BTрий-1, 2-5, 6-диан гидро вЂ” 3, ч-бис вЂ” (8вЂ”

-карбоксипропионил) -дульцита 2Н 0., 246,29 г (1 моль) 1,2-5,6-диангидро-3,4-бис-(P- карбоксипропионил)вЂ”

--дульцита растворяют в 3360,3 мл

5%-ного (по весу) бикарбоиата натрия с пост Оя иным ле1)емея ива Кием при КОм натной температуре до тех пор, пока не прекратится образование двуокиси углерода. Полученный раствор отфильтровыва:от и лиофилизуют. Получают

426,29 г (1 моль/100%) динатрий-1,2-5,о-диангидро вЂ ",4-бис-(IJ-карбоксипропионил)--дульцит 2Н„О. В стабильном

2п негигроскоиичьом (при комнатной температуре) веществе установили число колец, которое составляет 99%.

1п". -c)!er(1э." 1 725 cM (сложный эфирный карбонил), 1680 см (кислот, 95 иый ка.рбонил), Характерная для кислотных гидроксилов полоса в 3500-2800 см "отсутствует.

Вычислено, %: С 39,447; Н 3,783.

С9 -I, О,, NB. 2H,0

Найдено, %;. С 399440; Н 3,780.

1! О)1ученньle соединения были подвергн: ть1 фармакологическим исследова.н ням.

Оценены тераг(евтические свойства

35 следующих соединений:

А = 1, 2-5,, 6-диан гидро-3, 4-диацеTIIJi)Jульцита (Дз. А С Д А Д) 9

В = 1,2 вЂ”.596-диангидро-3,4 вЂ” бисвЂ(P карбометоксипропионил) -дульцита (!IJ. Su Д А Д вЂ” диметиловый сложный

-эоя "р ) 9

1,2-596-диангидро-= 4-иисвЂ” ф-фенилпропионил)-дульцита;

С-2 = 1,2-5,6-диангидро-3,4-бисвЂ(Pr вЂ” карбоксипропионил)-дульцита (Д-ь S Д A )|,);

С-4 =. 1 9 5,6-диангидро-3-(P-карбоксипропионил)-4-ацетилдульцита;

С-. > = 1,,2 "596-диангидро-3-(1З--карбоксипропионил)-4-(13-карбометоксипропиоHил,-дульцита;

С--6 = 1,2--5,6-диангидро-3-(P- ка1эбоксипропионил) -4-(й-фенилпропионил) "цульцита.

Укаэанные соединсиия9 где А9 В H

С являются диспожными эфирами в

3.4-положенlr!r 1,2- 5 6- иангидро1225437 4 дульцита (Д А Д), не содержат никаких свободных карбоксильных групп.

Соединения С-2, С-4, С-5 и С-6 также являются дисложными эфирами в 3,4-положении Д А Д, но соединение С-2 содержит две, а соединения С-4, С-5 и С-6 одну гидроксильную группу.

Осуществлены следующие исследования: усвоение энзима; тест на токсичность; определение дозовой зависимости ингибирования роста опухоли, гематоксичности и летальных эффектов для близких соединений, полученной отдельно на одинаковых моделях; терапевтические индексы, полученные на различных твердых, способ- ных к трансплантации опухолях гры- зунов; ингибирование роста опухоли в твердой системе Саркома l80, влияние отдельной и повторяемых инъекций; мутагенность.

Усвоение энзима:

Соединение В пытались превратить в соединение С-2 с помощью энзимного гидролиза при следующих условиях: время. 0,5: 1,0; 2,0; 4,0; 6,0; 24 0 ч; температура 37 С; буфер: 1/15 М фосфата; энзим: химотрипсин, трипсин, ацилаза, ацилаза jl

Согласно оценке при указанных условиях все сложно эфирные соединения В расщепляются с одинаковой скоростью. Следовательно, метиловый сложный эфир не может быть селективно разложен и трансформирован в кислотную форму.

СН вЂ” О вЂ”, СО

-(СН) -С-ОСН

1 з () О близких к С-2, полученная отдельно на одинаковых моделях: метод: самцам крысы l istor лекарства были введены через 24 ч после заражения 2 х 10 клетками 1Уа11<ег, Эффективность определяли па дозам, вызывающим 50Е-ное ингибирование опухоли при взвешивании на десятый день. Дозы, приводящие к 502-ному уменьшению гранулоцитов, оцененных на четвертый день, служили в качестве основ для сравнения гематоксичности.

Отношение минимальной летальной дозы,(!Д1 ) к минимальнои эффектив дозе (МВЛ = E i о ) Рассматривали как терапевтический индекс.

Согласно данным табл. 2 соединение

С-2 активно против опухоли в такой же дозовой области, как производные близких по структуре соединений А, В и С (1.Д 13 17 мкмоль/кг), в то время, как соединение С-2 менее токсично (более чем в два раза), чем все другие вещества, указанные здесь.

Следовательно, терапевтический индекс

С-2 в два раза .более предпочтителен, чем индекс любого другого члена группы.

Терапевтические индексы, получен30 ные на различных тверлых транспланб тируемых опухолях грызунов, даны в табл. 3.

Ингибирование роста опухоли в твердой системе:

Саркома 180: влияние отдельной и повторяемых инъекций.

Метод. небольшие образцы твердой

Саркомы 180 были инокулированы на кожу самца мыши Sviss. Интраперитональное примене ие лекарства к груп40 пе из шести животных начали на следующий день, на 11-й день опухоли были удалены для.оценки.

Данные отдельной и повторяемых инъекций на ингибирование роста опу45 холи в твердой системе Саркома 180 приведены в табл. 4.

Острая токсичность.

В табл. 1 приведены данные острой токсичности. (Найдено, что соединение С-2 наименее токсично из всех близких по структуре соединений как для мьппи, так и для крыс.

Дозовая зависимость ингибирования. роста опухоли, гематоксичности и летальных эффектов для соединений, 50

Отсутствие мутагенности соединения С-2 в анализе Салмонелла/микросома:

Все испытуемые производные алкилирy÷îùèõ сахарных спиртов за исключением С-2 были мутагенны в штаммах

TA 1535 и TA 100 по результатам анализа Салмонелла/микросома. Данные относительно мутагенных и токсичных эффектов 1,6-дибром-дульцита, 1,2-5,6 вЂ” диангидродульцита, 1-бром-3,51225487

;-.-!г:;,родуль!;,>!тя и 1,2-эпокси-3,6-янг"цгодупьцита известны.

Даже с. использованием микросомных, энз!с.!ол, полученных не только из пе«!. ни крысы, но также из легкого крысы, -„о !ки >!ы!>>и или печени хомяка, соед.«!i-;L-.!Hå С-7 не проявляет мутаген,:ос«л .< «штаммям TA 1535 и ТА 100.

Сз:.д!;>!еь«ие С-2 также не проявляет

i ;у"! а ее,; -«ости к штаммам ТА 1357, ТЛ 1538 !« ТЛ 98 в присутствии или ог".утс"в,;:е смеси S-9, полученной из ! с вь! !«! o ! -;. гягенность соединений А и В

r!.-«å!>,. явлена в табл. 5 и 6.

С,,; ..:снс эксперименту соединение

0-2 кя:=.ялос немуТагенным. Это

«кя>::. т.-!ь>уетс» тем, что концентрация соо>-;;! епил С-2 вплоть до 10 микроi р«"и::/;.;...: ти;i;.а не уменьшает числа бак- с >:. я.!=,:-"ьгк кле гок, произрастающих о 4я, I!«è0 среде ° .,:,; ако соединение В вызывает

IÎ0- .-"-крягное увеличение числа бактор:-,зль>!ь>х клеток, произрастающих в

«орi,.:., oной среде.

С т;:;>-ой стороны, соединение В вЂ”.«ь!зь „. с««: i0-! 4-кратное увеличение

--:еве-р" нитных пластинок, в то

:;рг .;:, как высокая концентрация в

1, 10 >! с!иг!>я>!м/пластина является!,;!.i:ëñío сравнению токсикологичесфармакологических данных, мута>ел: о::ти . -.,eçóëüòàòñâ экспериментов

;о у=:,-о "..и>о э.:-:зимов свободные карбоксил .нь!е гру.вЂ,:пы в соединениях С-2., ! -4, С-5, С-6 проявляют такие биоло::и"-;с-с!с,;е свойства молекул, которыми

« е,,Úà.!,",а!от молекулы, Не содержащие с зоб одньл карбоксильных групп.

Характеристические данные антиопухолевой активности соединений А, В и С„ оцененные на трансплантированньгх опухолях, являются существенно

>!енeе предпочтительными по сравнению с характеристическими данными соедипений С-2, С-4, С-5 и С-6, содержащих ! в >бодную карбоксильную группу.

?. Терапевтические индексы соединен..«>! В, содержащего две карбометокси--;:.упгп., являются также менее предло=!тительными по сравнению с такими же « войст«3AM!! соединении С-2, С-4, С.-5;:. 0-6. Из этого можно предположит-., то кярбометокси-пропионильняя

"ру.« вЂ :а,. з:мещающая 1,2-5,6-диангидрод,-; - !. г (, A Д) в 3 и/или 4-м положениях„не вызывает у>!е.>иче«!>!!я тс ряпевтичеcKQA BKTHBHAcTH кяK «: B06oIlн!«!«". карбоксильные группы, замещающие

Д А Д в таких же положениях.

3. Отсутствие мутагенности в случае соединения С-2, содержащего свободные карбоксильные группы (в противоположность другим мутагенным производным бифункционального гексита, особенно соединения В, содержа!цего две кярбометокси-группы), показывает, что присутствие карбоксильной группы вносит существенные изменения в биологическую эффективность.

Мутагенность соединений А и В представлена в табл. 6.

4. Энзимная система живого органа не способна к трансформации соединения В в соединение 0-2, содержащее свободную карбоксильную группу.

Следовательно, соединение Б не может рассматриваться, как предшественник соединения 0-2. Это иллюстрируется не только существенным биологическим различием, но также включенными здесь результатами экспериментов по усвоению энзимов.

5. Терапевтическая активность соединения А, содержащего две ацетильные группы, существенно ниже терапевтической активности соединения

С-4, содержащего не только ацетиль" ную, но также и карбоксильную группу.

6. Соединение С, содержащее две фенилпропионильные группы, обладает менее предпочтительной терапевтической активностью, чем соединение С-6, имеющее одну Р -фенилпропионильную и одну свободную карбоксильную группы, 7. Предпочтительный терапевтический индекс соединений С-2, С-4, С-5 и С-6 проявляется в результате существенного уменьшения токсичности, которая связана с наличием свободных карбоксильных групп. Терапевтический индекс соединений С-2, С-4, С-5 и

С-6 в 8-15 раз лучше, чем терапевтический индекс соединений А, В и С, что является неожиданным и непрогнозируемым для соединений подобной структуры. Небольшое изменение химической структуры принесло существенное изменение характеристик фармакологических свойств. Такое улучшение терапевтического индекса, осуществленное изменением одной группы в молекуле„ является неожиданным, непрогноз«ируемьж и неочевидным.

1225487

Таблица 1

Чродоолжение табл. 1

Лекарство

LD для 1.Р для самца мыши крысы

Swis s" ЬЯзаогС-5

235

126

С-6

210

146

25,5

150

660

С-2

190

С-4

180

105

Таблица 2!

Индексы безопасности

ЕД ., лимф/ЕД, W

Токсич ИнгибиЛекарство

Терапевтический индекс

LDÄ, W/ЕЛ„

Белые рование опухоли, импланность у мг/кг гранулоциты крови

ЕД о гран, мг/кг тирован ной по

Walker

ЕЛ,о ° мг/кг

5,6

25,5

3,6

110

6,4

8,8

8,2

8,5

Терапевтический индекс, указанный в Декларации, относительно соединений А и С-2.

С-2 190

С-4 105

С-5 126

С-б 146

7 7,4

12,5 6,4

5,0 38

5,5 19

5,7 22

LD„ определяли на нормальных самцах мыши Swiss весом 27-31 r.

После одной инъекции группа иэ шести мышей при одной дозе была прослежена в течение 21 дня. LB„ îïðåäåëÿëè на крысах WistorWalker, больных раком. Инъекции лекарства давали через 24 ч после трансплантации опухоли группе из шести крыс и вели наблюдения в течение 10 дней.

Белые лимфовЂ” циты крови °

ЕД,, лимф, MI /к г

1225487

Таб лица 3

Импланх14:интр .

ТЛ /ЕД

50 БО

180х8 интр.

МТД/ЕД, хТ интраперитонально

/ д

Лекарство

Терапевтический