Способ получения иммобилизованных нуклеиновых кислот

 

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

„„SU „„1230187 А 1 (50 4 С 12 И 11/00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ = ; Г663М3

,;Ц" :- ;л :.. ВИЛ

;-;А

К А BTOPCHOIVIY СВИДЕТЕЛЬСТВУ вания достигается как использованием этидиумбромида, так и подбором опреде- > ленных соотношений этидиумбромида и

СН-агарозы..Увеличение этого соотно- в р шения до 1:150 приводит к уменьшению прочности связывания нуклеиновой кислоты с матрицей, что вызывает элюцию нуклеиновой кислоты и ухудшение. свойств сорбента. Высокие концентрации этидиумбромида (соотношение 1:50) позволяют эффективно провести иммо- а билизацию. Однако высокая прочность образующегося комплекса затрудняет процесс регенерации сорбента. Таким образом, использование обратимого способа иммобилизации нуклеиновых кислот в сочетании с подбором оптимальных соотношений этидиумбромид:

ГОСУДАРСТ8ЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 3650614/25-13 (22) 10. 10. 83 (46) 07. 06. 89. Бюл. ¹ 21 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт прикладной микробиологии (72) А.Н.Байдусь, П.В.Бабаева, Ю.В.Ремнев, Л.В.Коломбет и P.Â.Áoровик (53) 577. 15 (088.8) (56) Peonian И.S. et а1 "Covalent

attachement of nucleis acids to

agarose for affinity chromatography", 10, р. 424-42?, 1971 °

Potuzak Н., Dean P D.G. "Affinity adsorbents consisting of nucleis

acids. immobilized via activated polysaccarides", "Nucl Acids.Res".

1978, 5, ¹- 1, р. 297 — 303.

Изобретение относится к биологической химии, в частности к способам; получения сорбентов для аффинной хроматографии, и может, быть использовано при выделении белков, обладающих биологическим сродством к нуклеиновым кислотам.

Цель изобретения — обеспечение ре генерации сорбента, позволяющей уве- . личить кратность его использования.

Изобретение заключается в том, что иммобилизация нуклеиновых кислот на

СН-агарозе с помощью этидиумбромида (при соотношении 100: 1 " 145m 1) позво-i ляет получить. такой сорбент, в котором нуклеиновая кислота связана с матрицей обратимо. Обратимость связы-.

2 . (54) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИИИОБИЛИ-

30BAHHbIX НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ, заключающийся в связывании нуклеиновой кислоты с активированной агарозой отмывании несвязавшейся нуклеиновой кислоты и использовании комплекса нуклеиновой кислоты с агарозой в качестве аффинного сорбента, о т л и— ч а ю шийся тем, что, с целью обеспечения регенерации сорбента, позволяющей увеличить. кратность его использования, проводят связывание нуклеиновой кислоты с СН-агарозой с .помощью этидиумбромида при соотношении этидиумбромида с СН-агарозы от 1:100 до 1: 145.

3 12301

СН-агароза (1: 100 — 1: 145) позволяет обеспечить эффективную и многократную регенерацию сорбента. Проведение

10, циклов регенерации не приводит к уменьшению эффективности иммоби5 лизации нуклеиновой кислоты. Так как без регенерации сорбент может быть использован 5-6 раз для выделения ферментов, то за счет его регенерации кратность использования возрастает в 10 раз до 50-60 раз. Положительный эффект заключается в том, что при использовании предложенного способа получения иммобилизованных нук леиновых кислот становится возможной

;простая и эффективная регенерация целевого продукта,,в процессе которой заменяется только нуклеиновая кислота, а матрица со связанным носи- 20 телем остается неизменной.

Способ иллюстрируется следующими примерами.

П .р и м е р 1. Стадия А. Приготовление этидиумбромидагарозы. 25

3 r СН-агарозы (Олайнский химический завод) суспендируют в 10 л дистиллированной воды рН 4-6,0. К .суспензии добавляют 13,3 мл этидиум-бромида, растворенного в 10 мл дис- 30 тиллированной воды. Отношение этиди., умбромид: СН-агарозы равно 1: 100.

К полученному раствору при постоянном перемешивании добавляют цикл ог ексил — 3- (2-морфоаминоэтил) -к ар35 бодиимид мето-п-толуолсульфонат до конечной концентрации О, 1 И, поддерживая рН раствора в пределах 4,5-6,0 в течение 1 ч .при комнатной температу.ре. При постоянном перемешивании 4О смесь выдерживают при комнатной температуре в течение 24 ч. Полученный сорбент отмывают 1 М раствором Nacl и этанолом до отрицательной реакции на этидиумбромид, определяемой по

УФ-поглощению.

Стадия Б. Иммобилизация PHK на этидиумбромидагарозе.

Этидиумбромидагарозу помещают в хроматографическую колонку и пропускают через нее раствор дрожжевой

PHK в 30 мИ калий-фосфатном буфере рН 7,0 с 2,5 М NaC1 до появления оптической плотности. Отмывают сорбент 3 объемами этого же буфера, но без NaC1. Затем сорбент промывают

10 Мм калий-фосфатным буфером рН 8, 0 . с 2 мИ дитиотреитола (ДТТ), 0,2% .нонидет Р-40, 10 глицерина. Емкость

87 4 приготовленной таким образом колонки. составляет 55 мг PHK на 1 г этидиумбромидагарозы.

Стадия В. Регенерация этидиумбромидагарозы (проводится через 5-6 выделений фермента).

Через колонку с иммобилизованной нуклеиновой кислотой пропускают О, 1 M раствор Na0H (3 объема), затем немедленно промывают дистиллированной водой или нейтральным буфером. После этого колонка готова к новой иммобилизации. Колонку можно подвергать длительному хранению и многократной регенерации (10 раз) без изменения свойств сорбента. Сорбент используют для выделения PHK-.зависимой ДНК-поли-, меразы (ревертазы).

130 мг вируса птичьего миелобластоза суспендируют в 6 мл 10 мМ калийфосфатного буфера, рН 8, О с 2 мМ дитиотреитола 0,2 нонидет P-40, 10% глицерина. К суспензии вируса последовательно добавляют при постоянном перемешивании 0,6 мл нонидет Р-40, 0,6 мл 10 . дезоксихолата натрия, 1,8 мл 4 М раствора КС1. Смесь вьщер;живают при 0 С в течение 15 мин, разводят в 10 раз исходным буфером и наносят со скоростью 15 мл/ч на колонку с этидиумбромид PHK-агарозой, уравновешенную в том же буфере. Ко лонку промывают; 50 мл исходного буфера и элюируют фермент линейным градиентом КС0 от 10 до 2500 мМ. За ! единицу активности принимают включение 1 нИ тимидинмонофосфата(Н ТИФ) в кислотонерастворимый продукт при

37 С в течение 10 мин. Выход фермента по активности 85 . Общее количество фермента 4500 единиц (по Спигельману).

Пример 2. Стадия А проводится так же, как в примере 1.

Стадия Б. Иммобилизация PKH на этидиумбромидагарозе.

Этидиумбромидагарозу помещают в хроматографическую колонку и пропускают через нее раствор дрожжевой

PHK в 20 мИ калий-фосфатном буфере рН 9,0 с 2,5 М Nacl до появления оптической плотности. Отмывают сорбент

3 объемами этого же буфера, но без

-NaCl..Затем сорбент промывают 10 мМ калий-фосфатным буфером рН 8, 0 с

2 мМ дитиотреитола, 0,2 нонидет

P-40, 10 глицерина. Емкость приготовленной таким образом колонки сосСоставитель В.Муронец

Техред М.Дидык Корректор .Л.Бескид

Редактор О.Волкова

Заказ 4719 Тираж 501 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.Ужгород, ул. Гагарина,1 01

S 1230187 6 тавляет 60 мг PHK на 1 r этидиумбро- Зтидиумбромидагарозу, приготовленмидагарозы. ную так, как описано s п р иHмMеeр е e 11, поСтадия В. Регенерация этидиумбро- мещают в хроматографическую колонку мидагарозы (проводится также, как в и пропускают через нее раствор ДНК примере 1). Эффективность иммобили5 из тимуса теленка в 30 мМ калий-фосзации РНК не снижается после 10 цик- фатном буфере рН 9,0 с 2,5 M NaC1 лов регенерации. до появления пика оптической плсгности. Отмывают сорбент 3 объемами того

Пример 3. Иммобилизация ДНК 10 же буфера, но без NaCl. Емкость полуна этидиумбромидагарозе. ченного сорбента составляет 64 мг на

Этидиумбромидагарозу, приготов- 1 r этидиумбромидагарозы. Регенерация ленную так, как описано в примере 1, колонки с иммобилизованной ДНК прово— помещают в хроматографическую колонку дится, как описано в примере 1. и пропускают через нее раствор ДНК 16 Пример 5. Стадия А. Приготовиз тимуса теленка ° в 30 мМ калий- ление этидиумбромидагарозы. фосфатном буфере рН 7 с 2,5 М ЯаС1 до 3 г СН-агарозы (Олайнский х:мипоявления пика оптической плотности. ческий завод) суспендируют в 10 мп

Отмывают сорбент 3 объемами того же дистиллированной воды рН 4,0 — 6,0. буфера, но без NaCl . Емкость получен- 20 К суспензии добавляют 19,3 мг этидиумного сорбента составляет 62 мг ДНК . бромида, растворенного в 10 мл дисна 1 этидиумбромидагарозы. тиллированной воды, и далее по приПример . 4. Иммобилизация ДНК Меру 1. Соотношение этидиумбромида на этидиумбромидагарозе. к матрице 1:145.