Способ определения активности гиалуронидазы

 

Изобретение относится к биохимии , а именно к способу определения активности гиалуронидазы. Цель изобретения - упрощение способа за счет использования в качестве субстрата стекловидного тела глаза. Фрагменты стекловидного тела смешивают с растворЬм гиалуронидазы. Активность препарата гиалуронидазы изменяют путем частичной замены растворов фермента раствором сывороточного альбут ина. В одни контрольные пробы с интактным стекловидным телом вводят по 0,01 мл дистиллированной воды, в другие - раствор гиалуронидазы с активностью 2,5 ед,/мг, но предварительно инактивированной нагреванием. Все пробы инкубируют при рН от 7,0-8,3 в течение 45-75 мин. Пробы стекловидного тепа переносят в чашки Петри. Отмечают момент нанесения проб и момент их полного высыхания. Активность гиалуронидазы выражают в относительных единицах, которые получают путем соотношения времени высыхания контрольной пробы с дистиллированной водой ко времени высыхания пробы с ферментом. 3 табл. S (Л to 05 СО vl

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН цЕ 81) (50 4 С 01 N 33/48

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

tlO ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 3817002/28-14 (22) 23. 11.84 (46) 07. 06. 86. Бюл. Н 21 (71) Московский ордена Трудового

Красного Знамени стоматологический институт им. Н.А. Семашко (72) В.А. Агафонов и С.И. Анисимов (53) 543.866(088.8) (56) Лабораторное дело. 1962, Ф 4, с. 28-32. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ

ГИАЛУРОНИДАЗЫ (57) Изобретение относится к биохимии, а именно к способу определения активности гиалуронидазы. Цель изобретения — упрощение способа за счет использования в качестве субстрата стекловидного тела глаза. Фрагменты стекловидного тела смешивают с раствором гйалуронидазы. Активность препарата гиалуронидазы изменяют путем частичной замены растворов фермента раствором сывороточного альбумина.

В одни контрольные пробы с интактным стекловидным телом вводят по

0,01 мл дистиллированной воды, в другие — раствор гиалуронидазы с активностью 2,5 ед./мг, но предварительно инактивированной нагреванием. Все пробы инкубируют при рН от 7,0-8,3 в течение 45-75 мин. Пробы стекловидного тела переносят в чашки Петри.

Отмечают момент нанесения проб и момент их полного высыхания, Активность гиалуронидазы выражают в относительных единицах, которые получают путем соотношения времени высыхания контрольной пробы с дистиллированной водой ко времени высыхания пробы с ферментом. 3 табл.

Таблица 1

Количество гналуронн" даэы, введенной в пробу стекловнд» ного тела, мг

Кол иче стso альбумина, введекяого в пробу стекловидного тела, мг

Отношение spe" меня высыхания

Время высыхания ияВремя высыхания проб стекловидиого тела с предварительно прогретой гналуроиндз9ОЙ> мни

Фактическая гналуронндаэяая активность в пробе, ад,lмг еия высыиня проб екловидного ела с гналунидазой н. ьбумннои; мнн интактного стекловидного тела ко време нн выснхания стекловидного тела с гяалу» ронидаэой н альбуммнои> относительные тактного стекловидного тела, мин ед»

1,136 0,01

1,11740,01

1 095 0 О1

1,0811 0,0!

1,068i0>01

1,03ИО>0!

1, 02510> 01

1>002 0>01

146>614>3

149,215>5

166,6 4,8

166,5!5>О

ll68,2Ì,О

162,9%5 3 !

70 3 5,8

О 25

169,5а4,0 154 8>5

0> 10

1,5

ll70 225 2

1>0

167,116>1

168>6 5,

165,024, 1

166,124 2

154,415,7

157>8+5,2

ll60, Ì5, 9

162,0+5, 1

0,15 162,9>5,2

163,51 4,0

165>1 3>2

165>9> 4>2

0,10

0,7

О 05 О 20

0,5

0,03

0,22

0,3

167>213,4 !66,9+3,5

0,25 О

Ф 12

Изобретение относится к медицине;" биохимии и медицинской технике, а именно к определению активности гиалуронидазы, препарат которой применяется в клинике, биохимических и медицинских исследованиях.

Цель изобретения - упрощение способа за счет использования в качестве субстрата стекловидного тела глаза, Способ осуществляют следующим образом, Пример. Фрагменты стекловидного тела доводят до рН 7,4, затем по 0,05 мл стекловидного тела набирают в стеклянные градуированные трубочки, Для каждого измерения берут по три параллельные пробы. В отмеренные объемы стекловидного тела с помощью микрошприца вводят по

0,01 мл раствора гиалуронидазы (активностью 10 ед./мг). В опытах активность препарата гиалуронидазы искусственно изменяют путем частичной замены растворов фермента раствором сывороточного альбумина. В одни контрольные пробы с интактным стекло36371 2 видным телом вводят по 0,01 мл дистиллированной воды. В другие — раствор гиалуронидазы с активностью

2,5 ед./мг> но предварительно инако тивированной нагреванием (при бО С

15 мин). Все пробы инкубируют в термостате при 37 С бО мин. Далее пробы стекловидного тела переносят в отдельные чашки Петри и распределяют на дне в пределах окружностей с диаметром 15 мм. Чтобы избежать движений воздуха и неравномерной скорости испарения воды из проб, чашки наполовину прикрывают крышками. Момент

15 нанесения проб и момент их полного высыхания регистрируют. Высушивание о проб проводят при 20-22 С, Активность гиалуронидаэы выражают в относительных единицах, которые получают путем

2О отношения времени высыхания контрольной пробы с дистиллированной водой ко времени высыхания пробы с ферментом.

В табл., 1 приведено определение активности гиалуронидазы предлагаемым способом при рН 7,4 и инкубации реакционной смеси 60 мин.

1236371 4 щим активность 1,5 ед, получена ее относительная активность, равная

1,095. Для получения фактического значения активности, которое равно

t,5 ед., необходимо величину t,095 умножить на величину 1,369. Эта величина получена из отношения 1,5 к

1,095. Поскольку между сравниваемыми величинами имеется определенная эа10 висимость, то для удобства переведения относительных единиц активности исследуемых препаратов гиалуронидаэы в известные единицы можно составить соответствующую номограмму.

Приготовление субстрата предлагаемым способом заключается во вскрытии глаза животного или трупа человека, извлечение сткеловидного тела и его отмеривании. Процедура приготовления субстрата по сравнению с известным, способом исключает операции очистки фрагментации, стерилизации, гомогенизации пупочных канатиков и растворения гиалуроновой кислоты.

Активность гиалуронидазы при предельных значениях рН (фактическая активность 1,0 ед./мг) и времени инкубации (фактическая активность

10 ед./мг) приведена в табл. 2 и 3.

Т а блица 2 рН тношение времени высыхания нтактного стекловидного теа ко времени высыхания текловидного тела с гиалуро идазой

1,082 - 0,02

7,0

1,079+0,01

8,3

Таблица 3

Время, Отношение времени высыхания мин интактного стекловидного тела ко времени высыхания стекловидного тела с гиалуронидаэой

Формула из обретения

1, 051 0,01

1, 1191 0,01

30

Составитель Н. Гуляева

Редактор С. Патрушева Техред В.Кадар

Корректор О. Луговая

Заказ 3083/46 Тираж 778

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Подписное

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Известную активность гиалуронидазы, выраженную в ед./мг, можно сопоставить с относительными едини35 цами активности, полученными предлагаемым способом, путем умножения этих относительных единиц на величину, полученную от отношения фактической величины активности к относительной величине активности. Например, после обработки пробы стекловидного тела раствором гиалуронидаэы, имеюСпособ определения активности гиалуронидазы путем смешивания суб» страта с ферментом, инкубации реакционной смеси и определения степени гидролиза субстрата, о т л и ч а ю— шийся тем, что, с целью упрощения способа, в качестве субстрата используют стекловидное тело глаза, инкубацию проводят при рН 7,0-8,3 в течение 45-75 мин, а степень гидролиза Субстрата определяют по соотношению скоростей высыхания реакционной смеси и нативного препарата стекловидного тела, причем большее соотношение соответствует более. высокой активности фермента.