Способ выделения лизоцима

 

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦЕЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК

„„80„, 12 14 (5п 4 С 12 N 9/36

OllHCAHHE ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А BT0PCHOIVIY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

llO ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3791 731/28-13 (22) 18.09.84 (46) 23.06.86. Бюл. Р 23 (71) Латвийская ордена Трудового

Красного Знамени сельскохозяйственная академия (72) В.я, Микельсоне, П.П. Андерсон, У.Я. Каулиньш и P.À. Ласманович (53) 577.15(088.8) (56) Патент Франции В 2157827, кл. А 61 К 19/00, 1972 °

Авторское свидетельство СССР

М - 247703, кл. А 23 J 1/08. (54) (57) СПОСОБ ВЬЩЕЛЕНИЯ ЛИЗОЦИИА из яичного белка путем экстракции в присутствии хлорида щелочного металла, отличающийся тем, что, с целью упрощения и ускорения процесса, проводят экстракцию лиэоцима водой при рН 3,0-4,0 и содержании хлорида щелочного металла в реакционной среде 0 5-4,0 мас.7 с одновременным нагреванием реакционной среды до 8095 С и последующим отделением осадка балластных белков.

1 12391

Изобретение относится к способам получения фермента лизоцима, широко применяемого в разных областях народного хозяйства, в том числе в медицине, пищевой промышленности, биологии.

Целью изобретения является упрощение и ускорение процесса выделения лиэоцима.

Лизбцим из яичного белка экстра- 10 гируют подкисленной водой с одновременной денатурацией белков яйца при повышенных температурах.

Лизоцим является сильноосновным белком мол. массы 14-93 тыс. (в эави- 15 симости от сырья) и в воде образует тель °

В яИчном белке при наличии среды, близкой к нейтральной, (рН 6-7) лизоцим с альбумином образует комплекс, 2О улучшающий устойчивость фермента, но:препятствующий выделению лизоцима. Понижение рН добавлением органических или неорганических кислот раэ" рушает комплекс с образованием соот- 25 ветствующих солей лиэоцима с органическими или неорганическими кислотами, которые лучше экстрагируются водой.

Для активации лизоцима, разрушения ЗО устойчивых суспензий .и улучшения экстракции, к раствору, добавляется соль щелочного металла (хлоридьч).

47

Отделение посторонних белков от лизоцима осуществляется повышением температуры до 80-95 С таким образом, чтобы коагулировалась основная масса посторонних белков.

Таблица 1

Температу Раствор после добавления яичнооC ro белка

Средний выход, X

Гелевидная масса, очень слабо 18 фильтруется

60+ 5

Гелевидная масса с последующим 28 выпадением хлопьев

70+5

80 + 5 Осаждение нитевидной массы пос- 43 тороннего белка

90 5

95 + 101

То же

55 ро, что может вызвать потери фермента лизоцима.

П р и и е р 2. Процесс проводят, как в примере 1. Отбирают 10 мл яичОптимальная температура для выделения лизоцима 80-95 С.

Ниже 60 С денатурация посторонних белков происходит недостаточно быстПример 1. 10 л свежего яичного белка без предварительного отделения овомуцина гомогенизируют перемешиванием и разделяют на 10 частей. В колбу вместимостью 3 л заливают 1 л воды,добавляют уксусную кислоту до достижения рН 3,5; включают мешалку, обогрев и растворяют 20 r хлористого натрия.

Устанавливают температуру, С:

1 и 2 опыты 60

3 и А опыты 70

5 и 6 опыты 80

7 и 8 опыты 90

9 и 10 опыты около 100

В горячий раствор при перемешивании добавляют 0 5 л яичного белка в течение 1-1,5 мин.

Полученную суспензию фильтруют и осадок промывают 0,5 л подкисленной воды, содержащей соль щелочного металла, фильтраты соединяют и охлаждают.

Выход лиэоцима в зависимости от температуры кислого солевого раствора приведен в табл. 1. з 1239147 ного белка и вливают в 30 мл раство-: ра, содержащего 2% хлористого натрия и уксусную кислоту различной концент-! рации.

Температура в рабочем растворе

85 + 10 С.

Ферментная активность фильтратов после выделения лизоцима из яичного белка в зависимости от концентрации уксусной кислоты представлена в 10 табл. 2.

Продолжение табл 2 г

4,3

0,75

1,0

800

4,25 1400

3,0

5,0

4,15 1770

3,9 1640

1520

Т а блица 2 6,0

3,85

Коцентрация сн,соон, %

Ферментная активность фильтратов, ед/мл лизоцима рН после окончания операции

5,95

5 3

0,25

0 5

500

4,63

Концентрация кислоты, %

Ферментная активность, ед/мл лизоцима рн раст

Серная Фосфорная кислота Лимонная кислота кислота

Г вора Соляная кислота

0,4 н,ро, Лимонная. 0 5 5

Не определена

Не определена

Нет Нет

0,005

0,075

HCl

Н So, НС1. 0,01

Не определена

Нет

015 4 .. Нет

Не определена н, яо4

Н РО

2350

2500

Лимонная 2

НС1 . 0,15 2;0-2,5 2550 2300 н 80 o,ç н,ро, Лимонная 5,0

7,Q 3,7 1460 t5

10,0 3,65 1370

Оптимальная концентрация уксусной кислоты, необходимая для начала образования солей лизоцима, составляет

0,5-5,0%.

Пример 3. Опыт проводят, .как в примерах 1 и 2.

Ферментная активность фильтратов . в зависимости от концентрации разных кислот дана в табл. 3.

I Таблица 3

1239147

Для определения лизоцима необходимо определенное количество любой кислоты, достаточное для образования солей лизоцима, независимо от водорддного показателя отдельной кислоты.

Пример 4. Опыт проводят, как в примерах 1 и 2.

Концентрация соли, 7

Ферментная активность, ед/мл лизоцима

Концентрация уксусной кислоты

NaC1 КС1 LiC1

7 рН

100

Нет

Нет

1900

1900 1850

1850 1700

2000 1700

1600 1600

4,2

4,18

1900

3,0

2200

3,0

4,2

1850

3,0

4,1

3,0

500

4,1

3,0

4,1

Оптимальная концентрация солей

0,5-4,0Х, При 5Х-ной концентрации солей наблюдается снижение выхода лизоцима.

Пример 5. Опыт проводят, как в примерах 1 и 2. 10 мл яичного белка добавляют к раствору, содержащему уксусную кислоту, и к чистой воде при

85+ 10 С.

Активность лизоцима при экстракции водой, ед/мл лизоцима, в среднем составляет О, Активность лизоцима при экстракции раствором уксусной кислоты без добавления хлористого натрия при рН 3,9 ч среднем составляет 1270 ед/мл лизоцима.

Предлагаемый способ получения лизоцима дает возможность по сравнению

ВНИИПИ Заказ 3354/2 1 Тираж 490 Подписное

Произв.-полигр. пр-тие, r. Ужгород„ ул. Проектная, 4

0,5 0,5 0,5

0 5 0 5 0 5

2,0 2,0 2,0

3,0 3,0 3,0

5,0 5,0 5,0

10,0 10,0 10,0

10,0 10,0 10,0

К раствору добавляют различные количества хлористого натрия, калия и лития для установления оптимальной концентрации солей при количестве яичного белка 10 на 25 мл раствора.

Ферментная активность фильтратов после выделения лизоцима из яичного белка в зависимости от концентрации

10 солей указана в табл. 4.

Таблица 4 с известным резко увеличить производительность установки и организовать промышленное получение фермента для различных отраслей народного хозяйства, в том числе для сельского хозяйства и пищевой промьппленности, ускорить процесс выделения до 16 ч; исполь.эовать отходы, получаемые при осуществлении предлагаемого способа, в пи. щевой промьппленности, например, в сыроделии, так как они представляют собой белок, содержащий около 10-307 остаточного лизоцима; сократить расход рабочего времени, что на полупромьппленных и лабораторных установках составит около 140 человеко-ча" сов на каждый кг лиэоцима; сэкономить энергоресурсы, так как процесс не требует громоздких холодильных блоков.