Способ получения сибиреязвенных протективных антигенов

 

Изобретение относится к медицинской микробиологии, может быть использовано в вакциносывороточном производстве при получении сибирейзвен Мой токсоидной вакцины, а также видоспецифичной сибиреязвенной антисыворотки . Цель изобретения - увеличение выхода антигенов за счет использования в качестве адсорбента при их очистке порошка из пористого стекла. В качестве фильтра используют колонку из пористого стекла с размером пор 700 - 2000 А, Это позволяет в условиях колоночной хроматографии одновременно и стерилизовать токсический культуральный фильтрат и адсорбировать из нег о не только антигены EF - I и LF - III, но и 88% PA-II. Элюцию ведут последовательно солевым раствором и дистиллированной водой и условиях колоночной хроматографии. 3 табл. ..

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН (51) 5 А 61 К 39/02

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (46) 23.02.91. Бюл. Ф 7 (21) 3806506/14 (22) 12 ° 07.84 (71) Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии (72) В.А.Абалакин, В.И;Покровский, Б.Л.Черкасский, П.Д.Решетов и Т.Д.Черкасова .(53) 615.372(088.8) (56) Сб. тр. МНИИЭМ МЗ СССР "Микробные антигены", М., 1978, т.ХХ, с,140142. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СИБИРЕЯЗВЕНННХ

ПРОТККТИВНИХ АНТИГЕНОВ (57) Изобретение относится к медицинской микробиологии, может быть использовано в вакциносывороточном пройзводстве прн получении сибиреязвенной токсоидной вакцины, а также видослецифичной сибиреязвенной антисыворотки. Цель изобретения — увеличение выхода антигенов за счет исполь- зования в качестве адсорбента при их очистке порошка из пористого стекла.

В качестве фильтра используют колонку из пористого стекла с размером а пор 700 — 2000 А. Это позволяет в условиях колоночной хроматографии одновременно и стерилизовать токсический культуральный фильтрат и адсорбировать из него не только антигены

EF — I u LF — III, но и 88Х РЛ-II.

Элюцию ведут последовательно солевьМ раствором и дистиллированнои водой ф в условиях колоночной хроматографии.

3 табл.

128

Изобретение относится к медицинской микробиологии, в частности к вякцннно-сывороточному производству и может быть использовано для получения сибиреязвенной токсоидной вакцины и нидоспецифической сибиреязвенной антисыноротки.

Пель изобретения — увеличение выходя антигенон за счет использования в качестве адсорбента при их очистке порошка из пористого стекла.

Вместо набора фильтров из обычного стеклянного порошка или стеклянных баллотини в качестве фильтра используют колонку иэ пористого стекла с контролируемым размером пор (7002000 А), которое позволяет н условиях колоночной хроматографии однонреиенна и стерилизонать токсический культуральный фильтрат, и адсорбиронать иэ него не только антигены

ЕР— I LF — III но и 88Х РА — II, Большая скорость протекания токсина через пористое стекло (выдерживающее высокое давление) и большая сорбционная его емкость делает процесс получения высокопроизводительным н простым. Кроме того, использование для элюции помимо соленых растворов дистиллированной ноды позволяет на 207 увеличить выход адсорбированных на стекле протектинных антигенон.

Пористое стекло с контролируемым размером пор (СКП) представляет собой тонко измельченный порошок, каждая частица которого пронизана большим количеством rrop, контролируемого размера (от 700 до 2000 А). Выпускаемые отечественной промьш ленностью марки

СКВ представляют достаточно однородный материал, размер диаметра пор у которого колеблется в пределах 20Х и характеризуется высокой скоростью протекания через них жидкостей. Способ поясняется следующим примером.

Пример. 10 л токсичного куль.турального центрифугата, обладающего отечной, защитной и летальной активностью, фильтруют на холоду (4-8 С) через колонку 40 х 500 мм, эаполненную СКП с размером пор 700-2000 А, предварительно хорошо отмыв ее дистиллированной водой. Скорость фильтрации 200-400 мм мин /см .. Затем колонку отмывают от несорбированных антигенон охлажденным эабуференным (0,0! и к-к фосфат>Ллй буфер рН 7,4)

0,97-ным раствором N;>(:1 . Собранный

2381 2 раствор объединяшт с фракцией токсина, прошедшей через колонку ("Ф").

Антигены, сорбированные на колон ке, элюируют охлажденным <до 4 C)

0,3 И карбонатным буфером рН 9,6.

Элюат собирают с помощью коллектора фракций по 20 мл. Выход антигенов тестируют по оптической плотности при

280 н р (GIt 280) .

После того, как оптическая плотность элюата снизится до (0,050, колонку начинают отмывать дистиллиронанной водой и вновь собирают элюированные антигены.

Собранные фракции антигенов концентрируют методом ультрафильтрации на мембране РИПОР— 4, а затем диализуют против 0,02 М аммонийацетатного буфера рН 7,0.

20 Полное фракционирование завершается в течение 2,5-6 ч в занисимости от .установленной скорости фильтрации.

Для восстановления колонки для последующего фракционирования ее промывают 0,6 л горячей азотной кислоты, а затем дистиллированной водой °

Оценка биологической активноститоксина и его фракций.

Протективную активность оценивают на морских свинках. Нивотным вводят подкожно по 10 мкг <по белку) препарата в смеси с полным адъювантом Фрейнда. Заражают через 20 дней после им6 мунизации 1:10 спор сибиреяэвенного штамма 71/12. Гибель животных учитывают в течение 10 дней.

Летальную активность оценивают на, инбредных мьппах линии CC57BR либо

40 ВА В/с. Внутривенно вводят препарат в объеме 1 мл. Гибель мьппей регистрируют в течение 5 дней.

Отечную активность оценивают на морских свинках. Внутрикожно вводят по 0,2 мл препарата. Отек оценивают по толщине кожной складки (в мм) по сравнению с контролем. .Антигенный состав фракций исследуют н иммуноэлектрофореэе против 0 видеоспецифической противосибиреязвенной сыворотки.

Фактор PA — II но фракции "Ф", прошедшей через СКП не сорбируясь, тестируют в виде термолабильного ком55 понента (инактивируется при 56 С в течение 30 мин), реагирующего с ви- . доспецифической антисывороткой. РфII из других фракций токсина идентифицируют по вышеуказанному препарату

1282381

PA — II в реакции иммунодифуэии по

Ухтерлоне.

Фактор I.F — III идентифицируют по способности давать в соединении с фракцией ВА — II смесь, летальную 5 ,п., я::,лчей СС5?ВВ и ВАЕ,В/с. Фактор

HF -- . . о..еи::..-:" эт по уровню аденилатцикла:Зной «ктинности (в нг на 1 Ml белка в 1 мин), тестируемой in vitro радиоиэотоиным методом. Белок опреде- 10 ллют методом Лоури.

Распределение факторов токсина по фракциям, полученным с колонки СКП, оценивают по количеству белка (в мг) в препаоатах Вà — Е, PA — II и Е.Х7 — 15

ХХХ, полученных в результате последующей, о и стки.

Па одной колонке, содержащей

500 см CKIi, были последовательно з

Аракционированы 4 серии токсина, 20

"абае;;". ;", ио 10 !i и полу-?PHb! сходные

íрофили элюции антигенных фракции.

В "оответствии с кривой элюции

:..итигень!, элюированные 0,3 М карбонатным буфером, можно разделить на 25 две фракции, восходящую (Эь) и нисходящую (Э ), и выделить антигены, -п элюированные дистиллированной водой (g ), Из;. ение биологических свойств 3Л этих фракций показало, что элюированные антигены (Эь+Э„+Э ) обладали выраженными протективной, отечной и летальной активностями.

Элюция сорбированных на СКП факто-35 ров токсина происходит в следующей последовательности (табл.2), сначала PA — ХI u HF — III (Э и Э ), а затем ЕУ вЂ” Х и Е.Š— ЕХХ (Э„ и Э ).

Предложенная нами дополнительная элюция дистиллированной водой позволила увеличить выход EF — I на 98% и

IF - III на 31% (табл.1).

Иэ общего количества РА — II, вы- 45 деленного иэ 10 л токсина, 12% содержится во фракции фильтрата "Ф" и

88% -- во фракции люата, тогда как

HF — I, Е.à — III обнаруживается только во фракции элюата. 50

Степень очистки проективных антигенов во всех фракциях элюата (Эь, Э„ и Э ) по сравнению с фракцией фильтрата (Ф) достигает 79-85 — кратности. 55

Таким образом, предлагаемый способ позволяет получить до 94,6% протективных антигенов (всех трех видов) при 80-кратной их очистке.

Основное достоинство предлагаемого способа по сравнению со способомпрототипом заключается в том, что при этих условиях происходит адсорбция на стекле не двух, а трех видов протективных антигенов, кроме того, предлагаемые условия элюции позволяют увеличить на 20% выход адсорбированных протективных антигенов. Эти достоинства предлагаемого способа позволяют увеличить в 2 раэа выход очищенных протективных антигенов и обогатить состав очищенных протективных антигенов фактором PA — II.

Кроме того, применение колоночной хроматографии на пористом стекле с . контролируемым размером пор позволяет увеличить производительность процесса получения, сократив затраты времени, упростить процесс, соединив воедино процессы стерилиэующей фильтра" ции и очистки, а также уменьшить число операций и тем самым сделав возможным его автоматизацию, применять предлагаемый способ для промьппленного производства.

Увеличение, ионной силы элюирующих растворов (до 1М NaC1 и до 3М НН„БСН) . с одновременным снижением рН до ?,0 либо снижение ионной силы до 0 (дис- тиллированная вода) и рН до 6,0 позволяет увеличить выход антигенов с колонки на 18-20%. При рН ниже 6,0 наблюдается быстрая утрата биологической активности протективных антигенов, (табл.2).

Таким образом, поставленная цель— улучшение качества препарата и увеличение его выхода — достигается благо-. даря двум основным отличительным осо -. бенностям предлагаемого способа, а именно, применению, порошка из пористого стекла, с контролируемым размером пор, адсорбирующего эффективнее и полнее протективные антигены, чем порошок из непористого стекла, при этом размер пор стекла в указанных пределах (700-2000 X) не влияет ре" шающим образом на его адсорбционную способность (табл.3), а также более полному снятию со стекла адсорбированных антигенов и исгользованию для элюции солевых растворов в более широком диапазоне концентраций (от 0 до 3M) и рН (6,0-9,6).

Формула изобретения

Способ получения сибиреязвенных протективных антигенов иэ культураль5 1282381 6 ного фнльтрата путем их адсорбции пористого стекла с размерами пор в на стеклянном порошке с последующей пределах 700-2000 1, а злюцию ведут элюцнеГ„ о < л и ч а ю m u и с я тем, последовательно соленым раствором что, с целью увеличения выхода про- и дистиллированной водой в условиях дукта и сокращения времени, в качест- 5 колоночной хроматография. ве адсорбента используют порошок из

Т а б л и ц а 1

Распределение сибиреязвенных прЬ гективных антигенов, во фракциях, полученных предлагаемым способом из 1П л токсина

ЬР-III

РА-IT

Фракции EF-I мг 7.

Фильт" нфи 0

0,92 5,3

0,92 12

Элюат

5,86 35,2

7,1 42,2

2,9 17,3

1,84 30

2 86 47

1,47 23

3,85 50

0,165 4,9

1,3 45

1,43 50

2,94 38

0 0

Э

Всего

16,7 100

6,1 100

7,7

2,9 100 таблица 2

В0-82

Вина«не ионной сита н рй на элиан«а адсорбированнмк «s CN1 а«тнгенов

Количество белка, полученного при разных вар«антек звоцнн, к иг

Последовательные зтапи злвцин

Ко«централ«и соли

2 З

7,2

7,7

9,6 0,3И

Карбонатный

Амаоиийацетатный, 7,0 0,02И .

1И На01

Аииоинйацетатиый

1S,7

1,8

7,0 0,02и

ЗМ HP SCH а

1,8 20

6,0 . 0

Всего злвироваи" ного белка

9,4

9,6 9,0 106

Через колоику f2x35 си), заполиеинув СКП (2000 А, 100 си ) фильтровали по 1 л токсина.

Таблица 3

)28238) Влияние размера контролируемых пор стекла на адсорбционную емкость стеклянного порошка.

Количество

Опыт Размер пор стекла, А элюнрованного белка, мг

700

20

6,2

1200

5,9

2000

*Через колонку фильтровали 1 л токсина.. Адсорбированные на стекле антигены последовательно элюировали 0,3 М карбонатным буфером рН 9,6 и дистилЛирОванной водой.

Составитель П. Бондарев

Редактор Л. Волкова Техред Л;Сердюкова Корректор М. Пожо Заказ 873

Тираж 445 Подпис"ое

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

1)3035, Москва, N-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Объем порошка из пористого стекла в колонке (1 M0 cM), см

Протективная активность профильтрованного токсина, Х