Способ оценки токсичности водных сред

 

Изобретение относится к биомониторингу . Изобретение позволяет ускорить оценку токсичности, повысить ее точность и дает возможность прогнозирования выживаемости рыб в исследуемых средах. Рыб помещают на 3 ч в исследуемую среду и берут пробу крови. При анализе пробы подсчитывают лейкоциты и микрои/или мезолимфоциты. Определяют среднее процентное содержание последних от общего количества лейкоцитов. О токсичности судят, сравнивая полученные данные с предварительно построенными калибровочными кривыми, отражающими зависимость между процентным содержанием мезои/или микролимфоцитов и их смертностью и длительностью жизни 50% рыб. 3 ил. 1 табл. S to со to О) 00 4ib

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (5D 4 А 01 К 61/00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н А BTOPCHOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ.И ОТКРЫТИЙ (21) 3887638/28-13 (22) 23.04.85 (46) 28.02.87. Бюл. Р 8 (72) В.С. Попов и А.А. Степаненко (53) 639.331.5(088.8) (56) Унифицированные методы исследования качества вод. M., 1983, с.139 161.

Иетлев В.В., Канаев А.И., Дзасохова Н.Г. Водная токсикология. М.:

Колос, 1971, с. 68-69. (54) СПОСОБ ОЦЕНКИ ТОКСИЧНОСТИ ВОДНЫХ СРЕД (57) Изобретение относится к биомониторингу. Изобретение позволяет ускорить оценку токсичности, повысить

„„SU,„, 1292684 A1 ее точность и дает возможность прогнозирования выживаемости рыб в исследуемых средах. Рыб помещают на 3 ч в исследуемую среду и берут пробу крови. При анализе пробы подсчитывают лейкоциты и микро- и/или мезолимфоциты. Определяют среднее процентное содержание последних от общего количества лейкоцитов. О токсичности судят, сравнивая полученные данные с предварительно построенными калибровочными кривыми, отражающими зависимость между процентным содержанием мезо- и/или микролимфоцитов и их смертностью и длительностью жизни

507 рыб. 3 ил. 1 табл.

1292684 2 после посадки в токсический раствор рыб). Изготовление мазков считают правильным, когда мазок не достигает края стекла, заканчиваясь в 1,5-2 см от него. Окраску и фиксацию препарак- тов производят сразу после изготове- ления и просушки мазка. Свежие препараты крови фиксируются растворами н- Май-Грюнвальда и Лейшмана (3-5 мин) с окраской азурэозином по Романовскому Гимза в течение. 20-30 мин, разбавляя азурэозин дистиллированной водой из расчета 1 капля красителя на 1 мл.

Хорошо окрашенные препараты получаются в том случае, если реакция воды од. (рН) будет нейтральной или слабощелочной. Величину рН определяют с поо- мощью кристаллов гематоксилина. Для этого в пробирку наливают не более

10 мл воды:и бросают в нее 1-2 крисх талла гематоксилина. Если вода начинает окрашиваться не раньше, чем через 1 мин, и не позже, чем через

5 мин, она пригодна для работы. Если о- реакция киспая, ее можно нейтрализо25 вать 17-ным раствором питьевой соды.

После окраски препараты хорошо ополаскивают сначала дистиллированной, а затем простой водой и ставят в штатив для просушки. Дифференцированный подсчет формулы крови осущесто вляет под обыкновенным световым мик. роскопом МБИ-1, МБИ-2 и др. Исследое- вание мазков крови проводится как ют 35 при дневном свете, так и с осветии телями ОН-24, ОИ-7 и др.

Выбираются наиболее удачно окрай шенные препараты. Применяется иммерр- сионный объектив. Наибольшая четкость ,ф достигается при окуляре х 7. Для поду) счета лейкоцитов используют восьмит- !клавишную счетную машинку. Подсчитывают все встречающиеся в поле зрения форменные элементы крови. Подсчет е- 5 начинают с середины мазка. е- Выделение микро- и мезолимфоцитов производят по признакам, обознае - ченным в таблице.

Название признаков

2-4 мкм

Диаметр клетки (без отростков) 4-7 мкм

Изобретение относится к биологическому мониторингу, а именно к спо собам оценки токсичности (загрязнения) вод, и может быть использовано в санитарной гидробиологии, водной токсикологии, рыбохозяйственной пра тике и при медикобиологических иссл дованиях.

Цель изобретения — ускорение оце ки, повышение ее точности и надежности, а также воэможность прогнози рования выживаемости рыб в исследуе мых средах и их смертности.

Предлагаемый способ позволяет ис пользовать рыб как удобную модель в биоиндикации и биотестировании прир . ных водоемов для изучения многих физиологических и патологических пр цессов.

На фиг. 1 и 2 показаны кривые за висимости смертности рыб в раствора токсических веществ группы фенола для таких рыб пресновоцных водоемов как Phoxinus phoxinus; Cottus (Leo

cottus) Pessleri Dyb. u Cottorameph

rus greuinki Dyb; на фиг. 3 — зависимость времени гибели 50Х особей тех же видов рыб в растворах те же токсикантов от содержания микролимфоцитов и мезолимфоцитов.

Сущность способа оценки токсич1

Мости водных сред состоит в том> чт рыб предварительно выдерживают для адаптации к условиям содержания в т чени 10 сут. После этого их помеща в аквариумы с исследуемой средой пр плотности посадки не более 1 шт/л и температуре среды, соответствующе температуре среды их обитания. Соде жание кислорода должно составлять

7-9 мг/л..Токсический раствор (сред в аквариумах заселяют один раз в су ки. Для опытов берут рыб из условно чистых в отношении загрязнения зон водоемов. Рыб выдерживают в исследу мой среде в течение 3 сут. Выбор вр мени обусловлен тем, что более боль шой срок ожидания приводит к непоср д ственной гибели рыб и при этом теряется смысл прогнозирования,, а уменьшение срока выдерживания рыб приводит к черезмерно неточному прогнозу смертности. После выдерживания у рыб берут пробы крови. Для одного анализа берется 5 шт. рыб. От каждой рыбы бе- 55 рется по 4 мазка крови из хвостовой артерии путем отсечения хвостового стебля в утренние часы (через 3 ч

Характеристика признаков

Микролимфоцит Мезолимфоцит

1292684

Характеристика признаков

Название призна— икролимфоцит Меэолимфоцит

5 ков

Круглая клетка без- отроКак правило, нголоядернаян

Форма клетки клетка, иногда стков с еле заметны10 ми отростками (до 2-3).Форма клетки определяется формой ядра

Форма ядра

Ядро выпукло- Ядро круглое вогнутое (бобовидное),иногда круглое

Темно-вишневый Светло-вишнеЦвет ядра вый

Неплотное расположение 25

РасполоПлотное,компактное расположение, с грубыми тяжами. жение хроматина

После подсчета микро- и/или мезо- 30 лимфоцитов определяют их среднее процентное содержание от общего количества лейкоцитов в препаратах от 5 рыб (по 4 препарата от каждой рыбы). Полученные значения сравнивают а заранее составленными калибровочными кривыми (для данного вида или видов рыб), которые отражают зависимость смертности рыб соответственно на 24 ч и 8 сут и гибели 50% 40 особей рыб от процентного содержания микро- и/или мезолимфоцитов.

Калибровочные кривые (фиг ° 1, 2 и 3) строят заранее по указанной схеме: выдерживают предварительно избран.45 ный вид рыб в чистой воде строго определенное количество дней. Затем перемещают этих рыб из аквариумов с чистой водой в аквариумы, в каждом из которых есть определенная концентрация одного и того же токсического вещества. Через 3 ч после помещения рыб в растворы токсических веществ у части рыб, которых выводят из эксперимента (обычно 5 шт,из каждого аквариума с одной и той же концентрацией токсиканта), берут кровь на анализ. По количеству рыб из оставшейся части определяют их смертность (в %) при каждой концентрации на

24 ч, 8 сут и т.д. Строят график,где на оси абсцисс откалывают величину смертности рыб (в %) на данный момент времени (например 8 сут), а »а оси ординат с одной стороны графика — количество микролимфоцитов (в %) за 3 ч (после начала токсического воздействия), а с другой стороны графика — количество меэолимфоцитов (в %) на 3 ч. Аналогичные графики строят для других видов рыб, при этом токсикологические опыты с каждым видом проводятся отдельно.Все данные для разных видов рыб обычно объединяют в одном графике для значений смертности на 24 ч или 8 сут и т.д. При этом наносят на график в виде точек реальные данные для разных видов рыб (фиг. 1 и 2). Затем ограничивают область, в которой помещаются нанесенные на график 95Х точек, сверху и снизу двумя линиями, показывающими интервалы, в которых меняются показатели. Эти линии проводят приблизительно (на глаз), но так, чтобы обе они были примерно на одинаковом расстоянии от воображаемой линии для средних величин показателей оси ординат. Например, на фиг. 2 среднее значение количества микролимфоцитов в 85%. наблюдается при смертности ОХ, à 65Х микролимфоцитов — при смертности 50%. В этом случае при смертности 0% обе линии проходят на одинаковом расстоянии сверху и снизу от значения 85% микролимфоцитов (т.е. на уровне 93 и

77%. микролимфоцитов), а при смертности 50Х на одинаковом расстоянии сверху и снизу от значения 65% микролимфоцитов (т.е. примерно на уровне 73 и 57Х микролимфоцитов).

Интервалы значений, в которые помещаются показатели смертности рыб (для фиг. 1 и 2 около +20 и +15%), тем шире, чем для большого числа рыб построены. калибровочные кривые. Если калибровочные кривые строят только для одного вида рыб, то интервалы смертности, как правило, будут меньше указанных, но даже большие погрешности в +15 и 20% смертности способствуют повышению точности анализа, поскольку он по сравнению с существующими позволяет дать количественный прогноз смертности рыб в исследуемой среде.

684 чения смертности всех трех приведенl ных видов рыб при данном числе соответствующих видов клеток.

Искомая средняя величина смертности всех видов рыб лежит посредине интервалов, изображенных на графиках фиг. 1-3. Два места пересечения 1 ерпендикуляра (к оси ординат) с верхней и нижней кривой каждого графика дают соответственно максимальные и минимальные значения смертности.

При осуществлении способа можно выявлять только микролимфоциты или только мезолимфоциты и определять токсичность по ним. Если же имеется возможность выявить оба нида клеток, то опрецеляют смертность рыб и токсичность водной .среды по средней величине смертности, полученной посредством подсчета каждого вида клеток, при этом обеспечивается большая надежность. Предлагаемый способ позволяет по состоянию микрои мезолимфоцитов вскоре после начала токсического воздействия определять уровни токсичности водной среды, лучшим критерием которого является степень выживаемости рыб.

Способ основан на закономерности, отражающей связи между соотношением микро- и/или мезолимфоцитов в первые часы после попадания рыб в токсическую среду, и показателями выживаемости рыб в последующие дни, недели и месяцы после начала токсического воздействия.

Пример 1. В 100-литровый аквариум с исследуемой водной средой помещают рыб вида Phoxinus phoxinus.

В качестве водной среды используют раствор гидрохинона концентрацией

0,01 мг/л. Рыб выдерживают в течение 3 ч, после чего берут пробы крови и подсчитывают количество микролимфоцитов и их процентное содержание от общего количества лимфоцитов, в результате которого получена цифра 80X.. . По заранее построенным кривым, изображенным на фиг. 1-3, устанавливают, что согласно графика на фиг.1 максимальное значение смертности на 24 ч 20Х. Нижняя линия графика не дает никакого значения смертности, так как перпендикуляр к оси ординат (в точке, соответствующей 80Х микро5 1292

На графиках фиг. 1-3 верхняя и нижняя кривые указывают соответственно на минимальные и максимальные зналимфопитов) с нижней линней не пе

peсекается, поэтому величина смертности на 24 ч может изменяться от 0 до 201, следовательно, среднее значение составляет 0 20Х.

Аналогично определяют смертность рыб на 8 сут по графику на фиг.2 и гибель 50Х рыб по графику на фиг.3, которые соответственно составляют

0 20 +20X и 60+40 сут. Проверка способа показала, что на соответствующий период времени гибель рыб составляет 2 и 8Х, à 50Х рыб гибнет на

60-е сутки. Таким образом, способ

15 обладает достаточной достоверностью.

Пример 2. В исследуемую водную среду (раствор гваякола концентрацией 10 мг/л) помещают рыб Cottus (I.ioñottus) Resslere Dyb и выдержи0 вают их в течение 3 ч, после чего у рыб берут пробы крови и подсчитывают как количество микролимфоцитов, так и их процентное содержание, которое составляет 69Х.

По графикам на фиг. 1-3 устанавливают,что на 24 ч максимальное значение гибели рыб составляет 35Х (верхняя кривая), а минимальное — 5Х (нижняя кривая), среднее значение

30 35X + 5Х смертности на 24 ч = 20 .

Среднее с допуском значение 20+15X .

Точно так же определяют значение смертности на 8-е сутки — 35+16X и гибель 50Х всех рыб — 15+10 сут.Проверка показала, что на соответствующие периоды времени гибель рыб составляет соответственно 18 и 34Х..

П р им е р З.В исследуемую водную щ среду (раствор ортокреозола концентрацией 0,1 мг/л) помещают рыб вида

Cottoromephorus greuinli Dyb. Остальные приемы, как в примере 1. Содержание мезолимфоцитов — ЗОХ. По графикам фиг. 1-3 находят, что на 24 ч и 8 сут гибель рыб составляет 36+13X и 58+ 18Х, à 50Х всех рыб погибнет на 6+6-е сутки. Проверка показала, что на соответствующий период време- ни гибель рыб составляет соответственно 30 и 50Х.

Пример 4. В исследуемую водную среду (раствор гваякола концентрацией 10 мг/л) помещают рыб вида

Cottus (Liocottus) Resslere Dyb.Определение содержания микролимфоцитов

69Х, мезолимфоцитов 16Х. По графикам фиг. 1-3 находят, что если судить по числу микролимфоцитов, то на 24 ч

1292684 и 8 сут гибель рыб составит соответственно 20+157 и 36+ 167, а 507. всех рыб погибнет на 15+10-е сутки. Если же судить по числу мезолимфоцитов, то гибель рыб составит соответственно 15+157 и 33+167, а 50% всех рыб погибнет Hà 21+13 сутки. Средние величины гибели рыб по данным .о числе микро- и мезолимфоцитов одновременно соответственно составят:

20X + 15% 367 + 337. о и э»о у

15+21 а 50% всех рыб погибнет на (сут)=

18 сут. Проверка показала, что на со- 1> ответствующий период погибает 18 и

347 рыб, а 507 рыб гибнет на 20-е сутки.

Предлагаемый способ позволяет увеличить скорость оценки токсичности в 4 раза при определении острой токсичности и более чем в 100 раз при определении слабой токсичности, что определяется возможностью учета коли- 2 чественных изменений мезо- и микролимфоцитов в сосудистом русле рыб, поскольку последние являются более лабильными и чувствительными критериями морфофункционального состояния организма рыб.

Формула и з обретения

Способ оценки токсичности водных сред, предусматривающий выдерживание в исследуемой среде рыб, взятие у них проб крови, анализ пробы с подсчетом лейкоцитов и определение токсичности по полученным данным, о т л и ч а ю — . шийся тем, что, с целью ускоре" ния оценки повыщения ее точности, а также возможности прогнозирования выживаемости рыб в исследуемых средах, выдерживание рыб осуществляют в течение 3 ч, при анализе крови наряду с лейкоцитами ведут подсчет мезолимфоцитов и/или микролимфоцитов, после подсчета устанавливают их среднее процентное содержание от общего количества лейкоцитов, а для определения токсичности сравнивают полученные данные с предварительно построенными калибровочными кривыми, отра" жающими зависимость между процентным содержанием мезолимфоцитов и/или микролимфоцитов у исследуемых видов рыб и их смертностью, а также длительностью жизни 507 рыб.

1292684

Ь, Cg. ;)

Ъ ъ -з в3

3,:

N ФО f0 gg

Стртнаспчь на Ю супчики, /©

Фиг. я

Составитель С. Филиппова

Техред M. oäàíè÷ Корректор Т.Колб

Редактор Э. Слиган

Заказ 300/1 Тираж 630

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д, 4/ i

Подписное

Производственно-полиграфическое предприятие, r. Ужгород, ул. Проектная, 4

ЯЮ

В е Ф) ь ®

М

Ъ е, 4

g f0

«,у

Ь

<8 80 ф Ф ъ а fg :Ф " о ф,Щ 39 40 5

4авю еибели Ы; омой, сутки

Фиг. Ю

Ъ

©«o

%o

9pð

27

97