Способ определения реакции организма на воздействие стрессорных факторов

 

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для оценки степени воздействия на организм факторов внешней среды, например для отбора лиц, пригодных к работе в экстремальных условиях, для определения предельно допустимой тренировочной нагрузки у спортсменов. - Цель изобретения - повьппение точности способа. Обследование проводят в период относительного функционального покоя и в период интенсивных тренировочных нагрузок. В сыворотке крови определяют активность кислой фосфатазы, катепсина Д и щелочной фосфатазы. Затем сравнивают эти результаты с исходными данными. При повышении активности ферментов на 20% и выше от исходного уровня определяюпатологическую реакцию организма, а при повышении активности меньше, чем на 20% - Нормальную реакцию организма. 2 табл. (Л СО о ел sj

СООЭ СОВЕТСКИХ

COUHAЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК

„„SU„„1293657 (50 4 G 31 N 33/48

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н А ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИИ И OTHPblYHA (21) 3774883/28-14 (22) 21 ° 04.84 (46) 28.02.87. Бюл, И 8 (71) Институт клинической и экспериментальной медицины СО АМН СССР (72) Н.Н.Маянская и Л.E.Ïàíèê (53) 615.475(088.8) (56) Авторское свидетельство СССР

У 800879, кл. С Ol N 33/48, 1981. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ РЕАКЦИИ ОРГА-, НИЗМА НА ВОЗДЕЙСТВИЕ СТРЕССОРНЫХ ФАК-, ТОРОВ (57) Изобретение относится к медицине и может быть использовано для оценки степени воздействия на организм факторов внешней среды, например для отбора лиц, пригодных к работе в экстремальных условиях, для определения предельно допустимой тренировочной нагрузки у спортсменов.

Цель изобретения — повышение точности способа. Обследование проводят в период относительного функционального покоя и в период интенсивных тренировочных нагрузок. В сыворотке крови определяют активность кислой фосфатазы, катепсина Д и щелочной фосфатазы.

Затем сравнивают эти результаты с исходными данными. При повышении активности ферментов íà 20Х и выше от исходного уровня определяют, патологическую реакцию организма, а при по-, вышении активности меньше, чем на

20X — Hîðìàëüíóþ реакцию организма.

Я

2 табл.

1293657

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для оценки степени воздействия на организм факторов внешней среды, например, для отбора.лиц,йригадных к работе в экстремальных условиях, для определения предельно допустимой тренировочной нагрузки у спортсменов.

Цель изобретения — повышение точности способа.

Цель достигается тем, что в сыворотке крови наряду с активностью кислой фосфатазы определяют активность катепсина Д и щелочной фосфатазы.

Способ осуществляется следующим образом.

Иэ 2-3 мл венозной крови стандартным методом готовится сыворотка, в которой проводят определение активности кислой фосфатазы, катепсина Д

20 и щелочной фосфатазы. Активность указанных ферментов можно определять с помощью микрометодов. В этом случае кровь можно взять из пальца с помощью скарификатора.

Предлагаемый способ испытан в эксперименте на 50 крысах. В качестве стрессорного фактора применяли физическую нагрузку разной интенсивности и длительности. По степени нарастания мышечного напряжения применяемые нагрузки распределялись следующим образом: 1 — умеренная однократная нагрузка — плавание в течение 3„5 ч без груза 2 — интенсивная однократ 2 ная нагрузка до утомления - плавание

3,5 ч с грузом, составляющим 4% от массы тела; 3 — хроническая нагрузка умеренной интенсивности — плавание беэ груза по 1 ч ежедневно в течение

10 дней; 4 — мышечная работы в истощающем режиме — плавание 3,5 ч с грузом после 10-дневной нагрузки по i ч также с грузом. Контролем служили ин4>5 тактные животные.

В сыворотке крови биохимическими методами определяли активность маркерных ферментов лизосом (кислой фосфатазы, катепсина Д) и ще1очной фосфатазы. Параллельно активность укаI занных ферментов определяли в тканях печени, сердечной и скелетных мышц.

При всех вариантах стресса в исследуемых тканях животных наблюдается активация лизосомального аппарата клеток, выражающаяся в лабилизации лизосомных мембран, повьппении активности лиэосомных ферментов, усилении аутофагоцитоза, снижения осмотической устойчивости лизосои. Степень акт :вации лизосом коррелирует с интенсивностью, длительностью воздействия и с тяжестью состояния напряжения организма. Эти изменения до определенного момента остаются обратимыми и не сопровождаются повреждением лизосом.

В сыворотке крови активность кислой фосфатазы, катепсина Д и щелочной фосфатазы нри физической нагрузке умеренной интенсивности (режим мьппечной работы 1, 2 и 3) как и у интактных животных минимальна.

При истощающей физической нагрузке (режим 4 мышечной работы) в исследуемых тканях: появляются признаки повреждения лиэосом и выхода лизосомных ферментов в цитоплаэму. В -.êàíÿõ при этом увеличивается активность и щелочной фосфатазы, что свидетельствует о повышении проницаемости наружных клеточных мембран.

В сыворотке крови увеличивается активность кислой фосфатазы (на ">%),. на 30-50% возрастает активность катепсина Д и щелочной фосфатазы.

При микроскопическом исследов-- нии препаратов из сердца, скелетных мышц и печени этой группы животных обнаруживаются следующие изменения. В миокарде возникают мелкоочаговые повреждения . кардиомиоцитов. Часть иэ них

I резко эозинофильна при окраске гематоксилин-зозином, другая — плохо воспринимает красители..При исследовании в поляризованном свете выявлено, что эти изменения связаны с повреждением сократительного аппарата мышечных клеток: контрактурой миофибрилл или их лизосом. Чаще обнаруживается контрактурный тип повреждения с последующим коагуляционным некрозом клеток. При микроскопическом исследовании скелетных мьппц по длине мышечного волокна нередко находят очаги, имеющие небольшую протяженность—

20-30 саркомеров, гомогеиные, ЕосКо видные, почти не структурированные, усиленно связывающие как кислые,так и основные красители. Обнаруживаемая в поляризованном свете анизотропия таких участков говорит о контрактурном повреждении сократительного аппарата мышечных волокон. В печени обнаруживаются гиперемия и отек стро1293657 мы, дистрофические изменения гепатоцитов и некроз отдельных клеток.

Таким образом, повышение активности лизосомных ферментов и щелочной фосфатазы в сыворотке крови отражает начало цитолиза и появление микронекротических очагов в тканях. На этой стадии изменения еще носят обратимый характер, и состояние ультраструктур в сердце, скелетных мышцах и печени полностью восстанавливается в случае прекращения нагрузки.

Продолжение нагрузки в истощающем режиме ведет к иэъязвлению кожи туловища и хвоста, животные слабеют и погибают. При вскрытии во внутрекних органах обнаруживаются множественные кровоизлияния, крупные некротические очаги в печени, поджелудочной железе, почках, миокарде.

Таким образом, наиболее ранними, доклиническими признаками развивающейся стрессорной патологии являются нарушение целостности лиэосомных мембран и увеличение активности лиэосомных ферментов и щелочной фосфатазы в сыворотке крови. Независимо от того, из какого органа, ткани, клеток происходят лизосомные ферменты, попадающие в кровь, повышение их активности в сыворотке крови может служить критерием оценки реакции организма при действии стрессорных факторов.

Пример 1. Спортсмен О, 1-й разряд по биатлону, обладает средним уровнем тренированности. Обследован в конце восстановительного периода (состояние относительного функционального покоя) и в период интенсивных тренировочных нагрузок при подготовке к соревнованиям.

Берут по 1,5 мл крови из пальца с помощью скарификатора, стандартным ме- 45 тодом готовят сыворотку и определяют в ней активность кислой фосфатазы, катепсина Д и щелочной фосфатаэы.Для бпределения активности кислой фосфаTB3bI О, 1 NII cbIBopoTKH иккубируют при 50

37 С в течение часа с 0,5 мл

1,35Х-ного раствора Р -глицерофосфата в 0,2М ацетатном буфере, рН 5,0.

Реакцию останавливают добавлением

1,2 мп 10Х-ной трихлоруксусной кислоты. После . центрифугирования при

3000 об/мин в течение 10 мин из надосадочной жидкости берут пробу для определения концентрации неорганического фосфора. Активность кислой фосфатазы выражают в микромолях Р„, отщеплейного за 1 мин, на 1 л сыворотки. Активность катепсина Д определяют, инкубируя в течение часа при 37ОС

0,1 мл сыворотки .с 0,5 мл 2Х-ного раствора гемоглобина. Реакцию останавливают добавлением 3 мл ЗХ-ного раствора трихлоруксусной кислоты. После центрифугирования в надосадочной жидкости определяют концентрацию кислоторастворимых аминокислот и пептидов с помощью спектрофотометрирова- -; ния при длине волны 280 нм. Активность катепсина Д выражают в микромолях тирозина, отщепленного за 1 мин на 1 л сыворотки. Активность щелочной фосфатаэы,определяют, инкубируя о в течение часа при 37 С 0,1 мл сыворотки с 1,0 мл 0,165Х-ного раствора

4-китрофенолфосфата натрия в 0,1 М глициновом буфере, рН 10,5. Реакцию останавливают добавлением 10 мп 0,2 н раствора NaOH, спектрофотометрируют при длине волны 420 нм. Активность щелочной фосфатаэы выражают в микромол1х 4-нитрофекола, отщепленного за

1 мин, на 1 л сыворотки.

В состоянии относительного покоя активность кислой фосфатазы, катепсина Д и щелочной фосфатаэы составляла соответственно 21,7; 10,2; 98,4. В предсоревковательком периоде активность укаэанных ферментов достоверно не изменялась к составляла соответственно 20,9; 11,7; 101,3. Электрокардиографическое исследование выявило неполное восстановление сердечной деятельности, что говорит о недостаточном уровне тренированности. Физическая работоспособность удовлетворительная. Таким образом, данные биохимического обследования свидетельствуют о неполном использовании потенциальных воэможностей сц>гакиэма. Рекомендуется оптимизация тренировочного процесса с равкомерньп1, увеличением нагрузок, адекватных функциональным возможностям организма.

Пример 2. Спортсмен В., кандидат в мастера по биатлону. Характеризуется высокой степенью тренированности. Прошел психокардиобиохымическое тестирование в конце восстановительного периода (состояние относительного функционального покоя) и при интесивных физических нагрузках в предсоревновательный период.

1293657 б

Берут 1,5 мл крови иэ пальца с помощью скарификатора, стандартным методом готовят сыворотку, в которой проводят определение активности кислой фосфатазы, катепсина Д и щелочной фосфатазы с помощью микрометодов.

В состоянии относительного функционального покоя активность кислой фосфатазы, катепсина Д и щелочной фосфатазы соответственно составляла

23,3; 7,2; 104,0 (активность ферментов выражена в микромолях субстрата, расщепленного за 1 мин, на 1 л сыворотки крови). В предсаревновательном периоде активность кислой фосфатазы, катепсина Д и щелочной фосфатазы у спортсмена возрастали на 24, 41 и

27Х соответственно, что служит основанием для заключения о неадекватности нагрузки функциональным возможностям смортсмена. В этот период с помощью ЭКГ обнаружены признаки снижения сократительной способности миокарда с явлениями гипоксин левого желудочка. Физическая работоспособность не снижена. Таким образом,,результаты биохимического контроля укаэывают на то, что несмотря на сохра-. нение физической работоспособности спортсмена, его организм функционально перенапряжен и находится в критическом состоянии, переходном от фиэиологической реакции на нагрузку к патологическим нарушениям. Рекомендуется снизить объем физических нагрузок, оптимизировать тренировочный режим.

Возможна фармакологическая коррекция путем введения кардиотонических и седативных средств.

Пример 3. Предлагаемым способом протестированы 20 чел ., здоровые мужчины в возрасте от 19 до 40 лет, участники экспедиции, состоявшейся в условиях зимнего Заполярья. Перед выходом в 200-километровый, двадцатидневный лыжныи поход все участники прошли комплексное медицинское обследование, по данным которого все 20 человек признаны практически здоровыми. Помимо обычного врачебного обследования были проведены также две нагрузки степ-тестом. Последние заключались в подъеме на ступеньку высотой 23 см в течение 5 мин с частотой 30 подъемов в 1 мин. Первая нагрузка производилась при температу- ре окружающего воздуха +2б С, втораяпри +13 С. В состоянии физиологического покоя и сразу после нагрузки иэ пальца брали с помощью скарификатора

1,5 мл крови, стандартным методом готовили сыворотку, в которой определяли активность кислой фосфатаэы и катепсина Д, используя микрометоды.

Таким образом, у всех обследуемых были получены по четыре значения активности каждого из указанных ферментов, В табл.1 показана активность кислой фосфатаэы и катепсина Д в сыворо1 ке крови у участников экспедиции (N2 m).

Как видно из табл.1, у группы в целом достоверных изменений активности кислой фосфатазы и катепсина Д при нагрузочных тестах не было. Однако у одного из членов экспедиции

{И., 19 лет) эти данные были другими.

В табл.2 приведена активность кислой фосфатазы и катепсина Д у одного из участников экспедиции °

Этот участник очень болезненно переносил трудности похода, уже с 3-го дня начал предъявлять жалобы на плохое общее самочувствие, мышечную слабость, головные боли, боли в подложечной области и в правом подреберье. На

10-й день был снят с маршрута и с диагнозом язвенная болезнь желудка от- ; правлен вертолетом в госпиталь. Та-.i ким образом,, результаты исследования лизосомных ферментов в сыворотке крови в данном случае показали резкое ее повышение в ответ на нагрузку стептестом как при температуре комфорта, так и при холодовом воздействии. Эти данные должны были послужить основанием для остранения И. от участия в походе, что позволило бы предупредить его заболевание.

Повышение активности кислой фосфатазы,.катепсина Д и щелочной фасфатазы на 203 и более по сравнению с исходным уровнем означает, что организм находится в критическом переходном состоянии между физиологическими и патологическими реакциями, и служит основанием для принятия мер профилактики, предупреждающих развитие стрессорной патологии.

Предлагаемый способ обеспечивает высокую достоверность, точность и чувствительность и позволяет своевременно решать вопросы защитных, профилактических или лечебных мероприя1293657

Таблица I о

При температуре +13 С о

При температуре +26 С

Фермент

Покой Нагрузка

Покой

Кислая фосфатаза 75,3+8,4

85,3+11,0

23,0+ 2,0

76, 7-+ 9,0

23,4"1,8

76,0+9,2

24,2+3,2

Катенсин Д 25,5+3, 7

Таблица2. о

При температуре +13 С

Фермент

Нагрузка Покой Нагрузка

Покой

Кислая фосфатаза 59,2

88,0

88,0

93,5

148Х

158Х

148Х

l00X

Катепсин

44,6

44,0

44,4

28,2

156Х

156Х

155Х

100Х

Составитель А.Рыбина

Редактор В.Ковтун Техред А.Кравчук Корректор Г.Решетник

Заказ 381/50 Тираж 7771 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д.4/5 производственно-полиграфическое предприятие,г.ужгород,ул .Проектная,4 тий. Способ может быть применено для регуляции тренировочного режима спортсменов, летчиков, космонавтов, для разработки оптимального режима труда и отдыха операторов диспетчер- 5 ских служб, для профотбора лиц, пригодных для профессиональной деятельности в экстремальных условиях. Кроме того, способ может быть использован в экспериментальной медицине и биологии при исследовании механизмов стресса для определения фазы перехода положительного адаптивного эффекта стрессорных воздействий в повреждающий.

Формула изобретения

Способ определения реакции организма на воздействие стрессорных факторов путем определения активности . кислой фосфатазы в крови до и после их воздействия, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повышения точности способа, в сыворотке крови наряду с активностью кислой фосфатазы определяют активность катепсина Д и щелочной фосфатазы и при повышении активности ферментов на 20Х и выше от исходного уровня определяют пата логическую реакцию организма, а при повышении активности. меньше чем на

20Х вЂ” нормальную реакцию организма,