Рекомбинантная плазмида @ 5 @ ,способ ее конструирования и штамм @ . @ @ 600 @ 5 @ -продуцент сайт-специфической эндонуклеазы @ п

 

Изобретение позволяет получить эффективный штамм-продуцент эндонуклеазы PVU II. Сконструирована реком .бинантная плазмидная ДНК pBP5RM, определяющая высокий уровень синтеза фермента Pvu II. Способ ее конструирования , состоит в том, что ДНК плазмиды pBR322 расщепляют эндонуклеазой Sal I, смешивают с ДНК из Proteus vulgaris, гидролизованной эндонуклеазой . Xho I, и фрагменты воссоединяют ДНК-лигазой фага Т4. Полученной смесью трансформируют клетки-Е.coll.и высевают на селективную среду с ампициллином . Из полученных клонов выделяют плазмидную ZpK, гидролизуют эндонуклеазой Pvu II и полученной смесью вновь трансформируют клетки E.coli. Отбирают клоны, устойчивые к ампициллину, из которых выделяют рекомбинантные плазмиды. Штамм E.coli C600P5RM - продуцент сайт - специфической эндонуклеазы Pvu II получен трансформацией плазмиды PBP5RM в штамм E.coli С 600. 3 с.п. ф-лы, 1 табл. с S (О ю со 4 00 1C

СОЕЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ÄÄSUÄÄ 1294824

А1 (So 4 С 12 N 15/00

ОПИСАНИЕ. ИЗОБРЕТЕНИЯ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3894497/28-14 (22) 06.05.85 (46) 07.03.8?. Бюл. У 9 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт прикладной микробиоло гии . (72) Б. М. Крамаров, С. О. Прохорова и В. В. Смолянинов (53) 575.224,2.577.2(048)(088,8) (56) Gin@eras T. R., Grubaugh ?.9

Suildkraut J. ВоЪегЬз R. J. Tuo new

restriction endonucleases from Proteus п1яагЬ. — Nucl. АсЫз Res, 1981, 9, р. 4525-4536. (54) РЕКОМБИНАНТНАЯ,ПЛАЗМИДА pBP5RM, СПОСОБ EE КОНСТРУИРОВАНИЯ И ШТАММ

Е.coli С 600 P5RM — ПРОДУЦЕНТ САИТСПЕЦИФИЧЕСКОЙ ЗНДОНУКЛЕАЗЫ Pvu II. (57) Изобретение позволяет получить эффективный штамм-продуцент эндонуклеазы Р гп 1Х. Сконструирована рекомбинантная плазмидная ДНК pBP5RM, onределяющая высокий уровень синтеза фермента Pvu II ° Способ ее конструирования состоит в том, что ДНК плазмиды pBR322 расщепляют эндонуклеазой

Яа1 I, смешивают с ДНК из Proteus

vulgaris гидролизованной эндонуклеазой Х} о Х, и фрагменты воссоединяют

ДНК-лигаэой фага Т4, Полученной смесью трансформируют клетки:Е.coli. u высевают на селективную среду с ампициллином. Из полученных клонов выделяют плазмидную Ê гидролизуют эндонуклеазой Рагс ХХ и полученной смесью вновь трансформируют клетки

R.со1i. Отбирают клоны, устойчивые к ампициллину, из которых выделяют Я рекомбинантные плазмиды. Штамм

Е.cpli C600PSRM — продуцент сайт— .специфической эндонуклеазы Pvu II получен трансформацией плазмиды рВР5БМ в штамм Е.coli С 600. 3 с.п. ф-лы, 1 табл.

1294824

Сайты узнавания

Расстояние между сайтами, тыс. пар оснований

Xho Х - Сlа 1

0,9

2 Сlа I - Hind ХХХ 0,2

3 Hind. IIl -Hind. ХХХ 1,8

Hind III -ясов Х

ZcoR I - Xho I

Изобретение относится к области микробиологической промьппленности и молекулярной биологии и представляет

:собой рекомбинантную плазмидную ДНК, определяющую высокоэффективный синтез сайт-специфической эндонуклеазы, способ ее конструирования и штамм, несущий эту рекомбинантную плазмидную ДНК вЂ” продуцент сайт-специфической эндонуклеазы Pvu Хl.

Целью изобретения является создание эффективнога штамма - продуцента эндануклеаэы Pvu ХХ, пригодного для быстрой очистки Pvu ХХ.

Поставленная цель достигается тем, чта сконструирована рекомбинатная плазмнда рБР5ВМ, онределяюцая высо1 кий уровень синтеза фермента Р"гп ХХ., Способ конструирования рекомбинатной плаэмиды основан на гидролизе ДНК из

P. vulgari эндонуклеаэой Xho Õ,, встраивании полученных фрагментов в ! векторную ДНК с последующим клонированием в Е..с011, и отбором рекамбинантов, содержащих ген эндонуклеазы

Р7п ХХа

B качестве штамма - продуцента сайт-специфической эндануклеазы . Wn ХХ использ лот штамч 6, coli 3О . СбООР5БМ.

Рекамбинантная плазмидная ДНК рБР5РМ размером 9000 пар оснований содержит ген эндонуклбазы,Ртп ХХ и состоит иэ ДНК рБН 322„ в которой по

Hal Х сайту встроен фрагмент ДНК, полученный нри гидролизе ДНК из

Р. гп1@агЫ эндонуклеаэой Хпо Х, <Ърагмент ДНК Р. vulgsris имеет размеры 4700 пар оснований и содержит 10 гайты для эндонуклеаз Сlа T., ЕсоР Х, и НЫЯ ХХХ расстояния между которыми приведены в таблице., Способ осуществляют следующим образом.

ДНК-плазмиды рБН 322 расщепляют эндонуклеазой Яа1 Х, смешивают с ДНК из Proteus гп1яег .з, гидролизованной эндонуклеазой Xho Х, и фрагменты воссоединяют ДНК-лигазой фага Т4. Полученной смесью трансформируют клетки Е.coli. и высевают на селективную среду с ампициллинам. Иэ полученчых клонов выделяют плазмидную ДНК, гидролизуют эндонуклеазой Pvu II и полученной смесью вновь трансформируют клетки E,со1ь., отбирают клоны, устойчивые к ампициллину, из которых выделяют рекомбинантные плаэмиды.

Штаммом — продуцент сайт-специфичесКоА 3HpoH JIeG3bt Pvu 1I полученный трансформацией плазмиды pBP5RN в ! штамм Е.со1 С 600;,обеспечивает синтез эндонуклеазы Р.гп ХХ в количестве не менее 100000 ац, на 1 г сырого ве-! ! са клеток, Штаы 1,,coli С 600 Р5 БМ депонирован во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов при

ВНИИ "Генетика" под Р Б 3272.

Штамм - Е.со1 С 600 Р5 БМ, содержащий плазмиду pBP5RN, характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки: клетки прямые,.палачкавиднай формы 1,2.-1,6 х 2,0 х 6,0 мкм, подвжкные, с перитрихальными жгутиками, грамотрицательные.

Культуральные признаки: хорошо растут íа простых питательных средах. При росте на мясо-пептонном агаре колонии гладкие, круглые,.прижаты, блестящие, серые, край ровный, мутные. При росте в жидких средах, мясопептонном бульоне, B-бульоне образуют равную интенсивную муть.Физиологс-бнохю ические признаки: растут в пределах 10 — 40 С при оптимуме рН от 6,,8-7,5. Б качестве источника углерода используют многие углеводы, спирты, органические кислоты, в частности глюкозу, фруктозу, арабинозу, лактозу, галактозу. Б качестве источника азота используют минеральные.ссли в аммонийной и нитратной форме, в органической фарме— пептон, аминокислоты, нитраты восстанавливают дс нитритов.

М(елатину не разжижают. Уреазная активность не обнаруживается. Индол не образуют.

94824 4

f0

20

30 мин при 5000 об/мин, пленку белков

55

3 l2

Устойчивость к антибиотикам. проявляют устойчивость к ампициллину.

Пример 1. Конструирование рекомбинантной ДНК.

При конструировании рекомбинантной плазмиды рВР5ВМ в реципиентную плазмиду встраивают фрагмент ДНК

P. vulgaris. Плазмидную ДНК pBR 322 выделяют из штамма Е.coli RR1, содержащего эту плазмиду. 10 г биомассы Е.coli RRI суспендировали в 20 мл

20%-ной сахарозы, 2 мИ MgC1, добавляли 10 мг лизоцима в 1 мл Н О, инкубировали при .0 С 5 мин, затем добавляли 0,25 M ЭДТА (рН 8,0) до конечной концентрации 40 мМ, инкубировали 10 мин при 0 С, добавляли 5 М

NaC1 до концентрации 1 М, 10% тритон

Х-100 до 1% и оставляли на ночь при

+4 С; Затем суспеизию центрифугировали при 100000 g 3 ч, к надасадач ной жидкости добавляли CsC1 (0,8 г на 1 мл раствора), центрифугиравали на поверхности жидкости отбрасывали, добавляли брамистый этидий до

0,4 мг/мл, после чего раствор центрифугировали 36 ч при 50000 об. мин на роторе 50,2 Ti. Зону, соответствующую сверхспиральной ДНК, отбирали, бромистый.этидий экстрагиравали изопропанолом, плазмидную ДНК осаждали этаналам, осадок растворяли в

0,5 М NaCl и дополнительно очищали

ДНК-хроматографией на колонке с Биагелем А-15. Фракции, содержащие

ДНК, объединяли, ДНК осаждали добавлением 2 объемов этанола, осадок отделяли центрифугированием, растворяли в Н О и в таком виде использовали в дальнейшем. ДНК Р. vulgaris выделяли после лизиса клеток лизоцимом, . как описано вьппе, с последующей фекальной децротеинизацией. После обработки фенолом водную фазу, содержащую ДНК, диализовали против 0,01 И натрий-цитратного буфера (рН 7,5)„ инкубировали 5 ч при 25 С 50 мкг панкреатической РНК-азы, затем вновь обрабатывали равным объемом фенола, последний затем из водной фазы удаляли диализом против 0,01 И натрийцитратного буфера. Полученный препараты ДНК P. vulgaris и РВН 322 испольэовали для получения рекомби-нантной плазмиды рВР5БМ. ДНК pBR 322 (1 мкг) и P. vulgarfs (3 мкг) гидролизовали в буфере 100 мМ трис-НС2 (рН 7,5), 10 мМ М С1„, 2 мМ дитиатреит соответственно эндануклеазы Яа1 I и X?io I в течение 1 ч при 37 С, затем растворы смешивалн, добавляли

АТФ до концентрации 0,07 мкМ и 2 мкл

ДНК-лигазы фага Т4. Объем реакционной смеси 100 мкл, реакцию проводят при 12 С 16 ч, затем 1 ч при 37 С.

П,р и м е р 2. Получение штаммапродуцента Pvu II.

Для получения штамма-продуцента эндонуклеазы Pvu II смесь рекомбинантных молекул ДНК, полученных после обработки ДНК-лигазой, трансформируют в штамм E.coli С 600, что позволяет использовать ега в качестве хозяина, содержащего низкое количество неспецифических нуклеаз, па сравнению с исходным штаммом Р, гп1garis. 50 мл культуры E.co/i С600 подращивают да 2-3.10 кл/мл, осажМ дают при 6000 g 15 мин при О С, затем дважды промывают 25 мл 0,1 М

СаС1 и ресуспендируют в 0,5 мл того же раствора. К 12 мл ДНК, полученной после лигазной обработки, добавляют 25 мкл компетентных клеток.

Смесь выдерживают 20 мин при 0 С, за30 тем 2 мин при 42 С и 10 мин при 20пС. переносят в 1 мл среды, индкубируют

2 ч при 37"С с аэрацией, Суспензию высевают в 50 мл среды, содержащей

50 мкг/мл амнициллина, выращивают до поздней логарифмической фазы, клетки осаждают центрифугираванием и выделяют из них сверхспиральную ДНК, как описано в примере 1. 5 мкг этой ДНК обрабатывают 1 ч при 37 С 10 ед. эндонуклеазы Рл? ТТ, затем проводят трансформацию, как описано вьппе. После трансформации клетки инкубируют в 1 мл среды 2 ч и высевают на чашки с 50 мкг/мл ампициллина. Трансформанты отбирают па устойчивости к ампициллину и чувствительности к тетрациклину. Клоны, удовлетворяющие этим условиям, высевают в 5 мл среды, выращивают до поздней логарифмической фазы, клетки собирают центрифугированием и тестируют в них содержание эндонуклеазы Pvu II.

Пример 3. Тестирование кланов на содержание эндонуклеазы Pvu II проводили следующим образом. Клетки клона, выращенные в 5 мл среды, суспендировали в 1 мл 0,01 M калий-фас- фатного буфера (рН 7,0), содержащего

1294826 сти к ампициллину, дает возможность стабильного культивирования клеток в процессе получения биомассы.

Формула изобретения

Составитель Н. Кузенкова

ТехредА.Кравчук Корректор С. Черни

Редактор Н. Егорова

Тираж 500 Подписное

ВНИИПИ Государственного коьплтета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Заказ 562/27

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

0,1 М ИаС1, и обрабатывали ультразвукам 3 мин при охлаждении льдом (aMплитуда 8 мкм). Обломки клеток осаждали при 40000 p: и в надосадочной жидкости определяли активность 5

Pvu TT. Аликвоты разводили от 1/5 до

1/200 и по 5 мкл из каждого разведения добавляли к 20 мкл реакционной смеси, содержащей 100 мМ трис-НС1 (рН 7,8), 10 мМ М С1, 0,5 мкг ДНК ®0 фага, инкубировали 30 мин при 37

37"С, Продукты реакции анализировали электрофорезом в геле 0,8Х агарозы, гель окрашивали бромистым этидием и фотографировали при облучении

УФ-светом. Фрагментация ДНК указывала на наличие s клетках культуры эндонуклеазы Pvu 1Т.

Клоны, в которых была обнаружено присутствие эндануклеазы Pvu II выращивали в 1 л жидкой среды и определяли в них количество эндонуклеазы Pvu ТТ в стандартных условиях (гидрализ 1 мкг ДНК g>ara+ в 50 мкл за 1 ч).

Штамм Е.coli С 600 Р5 БМ содержит фермента не менее 100000 ед. на 1 г биомассы. Незначительное количество неспецифических нуклеаэ дает вазможность тестировать количество энданук- 30 леазы Pvu IT непосредственно и клеточном экстракте. Тестирование Pvu Il в исходном штамме Р. vulparis nesos-можно из-за неспецифических нуклеas они же затрудняют очистку целева- 35 го продукта.

Таким образом, предлагаемые объекты позволяют получить штамм E.coli продуцент эндонуклеазы Рл ТТ. Уровень содержания фермента в предлагаемом штамме не менее 100000 ед, на

1 r сырого веса клеток, отсутствует эндонуклеаза Pvu I уровень неспецифических эндонуклеаз значительно ниже, чем в исходном штамме, что существенно для получения высокоачищенного препарата фермента, Рекомбинантная плазмида pBP5HN, несущая гель эндонуклеазы Р гц ТТ и ген реэистентноРекомбинантная плазмида рВР5ВМ, кодирующая биосинтез сайт — специфической эндонуклеазы Pvu II, имеет размер 9000 пар оснований и состоит из следующих элементов: ЕсаВ Т—

Sa1 Т вЂ” фрагмента плазмиды рВН 322, расстояния между сайтами 650 пар оснований, Xho I — Xho Т вЂ” фрагмента

ДНК Proteus vulgaris, содержащего ген эндонуклеазы Р ги ТТ .,и сайты Сlа Т

Hind lTI, Hind. TT1, EcoR I, расстояние между которыми (от ХЬо Т сайта)

900, 200, 1800, 1600 и 150 пар оснований соответственно, Sal Т вЂ” ЕсоВ Т— фрагмента плазмиды pBR 322, содержащего репликон плазмиды рВВ 322 и ген, ответственный за синтез бета-лактамазы (определяющий устойчивость к ампициллину).

2. Способ конструирования плазмиды рВРэНМ кодирующий биосинтез сайтспецифической эндонуклеазы, заключающийся ..з том, что ДНК плазмиды рВВ 322 расщепляют эндонуклеазой Яа1 I,, ДНК Proteus vugaris гидролизуют эндонуклеазай Xho I полученные фрагменты соединяют действием ДНК вЂ” лигазы этой смесью трансформируют Е.coli, выделяют из клеток плазмидную ДНК, обрабатывают

Pvu lT, затем вновь трансформируют клетки Е.coli. среди трансформантав устойчивых к ампициллину отбирают клоны, обеспечивающие синтез эндонуклеазы Pvu ТТ, из которых выделяют целевую рекомбинантную плазмиду.

У

3. Штамм ЕзсЬегэ .chia coli С 600

P5 BN (коллекция центрального музея промышленных микроорганизмов института "ВНИИГенетика", коллекционный номер В-3272) — продуцент сайт — специфической энцонуклеазы Ргп 1Т.