Питательная среда для обнаружения микроорганизмов рубца, усваивающих азот мочевины

 

Изобретение относится к микробиологии , а именно к питательным средам для обнаружения микроорганизмов рубца , усваивающих азот мочевины. Цель изобретения - повышение чувствительности среды и точности выделения. Среда дополнительно содержит натрий изомаслянокислый, холинхлорид и цианкобаламин при соотношении мочевины. и углеводов 1:5-10. В результате использования предлагаемой среды интенсивность роста микроорганизмов, использующих азот мочевины, повышается на 5-15%. Амилазная активность микроорганизмов возрастает в 7-12 раз по сравнению с известной средой Кучинского. Изобретение может быть использовано в научных исследованиях и в практике кормления жвачных животных для объективной оценки течения микробиологических процессов в преджелудках и вклада микроорганизмов, усваивающих азот мочевины, в аминокислотное и протеиновое питание жвачных животных . 4 табл. (О (Л

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСН ИХ

РЕСПУБЛИН (19) (11) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 3891269/30-13 (22) 25.04.85 (46) 30.04,87. Бюл. Р 16 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт физиологии, биохимии и питания сельскохозяйственных животных (72) И.А.Долгов (53) 577.15(088.8) (56) Gibbons R.I. Doetsch R.N.

J. Bacteriol 1959, 77, 4, 417.

Кучинский З.Г. Некоторые микроорганизмы рубца жвачных животных, усваивающих азот небелковых соединений, Канд. дис. Боровск, 1967. (54) ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ РУБЦА, УСВАИВАЮ ЩИХ АЗОТ МОЧЕВИНЫ (57) Изобретение относится к микробиоо логии, а именно к питательным средам для обнаружения микроорганизмов руб(51) 4 С 12 N 1/20//(С 12 N 1/20, С 12 R 1:04) ца, усваивающих азот мочевины. Цель изобретения — повышение чувствительности среды и точности выделения.

Среда дополнительно содержит натрий изомаслянокислый, холинхлорид и цианкобаламин при соотношении мочевины и углеводов 1:5-10. В результате использования предлагаемой среды интенсивность роста микроорганизмов, использующих азот мочевины, повышается на 5-157. Амилазная активность микроорганизмов возрастает в 7-12 раз по сравнению с известной средой Кучинского. Изобретение может быть использовано в научных исследованиях и в практике кормления жвачных животных для обьективной оценки течения микробиологических процессов в преджелудках и вклада микроорганизмов, усваивающих азот мочевины, в аминокислотное и протеиновое питание жвачных животных. 4 табл.

13069

Изобретение относится к микробиологии, а именно к питательным средам для культивирования микроорганизмов, усваивающих азот небелковых соединений, в частности азот мочевины, и может быть использовано в практике кормления для объективной оценки вклада микроорганизмов в аминокислотное и протеиновое питание жвачньгх животных.

Цель изобретения — повышение чув- г0 ствительности среды и точности выделения.

Изобретение заключается в том, что осуществляют подбор компонентов среды иэ расчета оптимального соотно- 15 шения мочепины к углеводам как 1:5-10, а также более полного удовлетворения потреоности рубцовых микроорганизмов в стимуляторах роста за счет введения цианкобаламина, холинхлорида и 20 натрия изомаслянокислого.

В условиях вивария института на лактирующих коровах, имевших фистулы рубца и внешние анастомозы 12-ти

> перстной кишки, проведено 3 опыта.

Изучали микробиологические процессы в рубце коров при введении в их рацион протеина разной деградируемости> KoòÎpéÿ В Опытах 1> ? и 3 состав ляла 53,1; 48,8 и 76,97. соответст- 30 венно.

Пробы содержимого рубца для микробиологических исследований берут через 3 ч после утреннего кормления жи-. вотных в конце каждого опыта. 35

Готовят среду следующего состава, мг/л:

Калий фосфорнокислый

2,0

2,0

2,0

2,0

2,0

2,0

0,5

Тиамин солянокислый

Никотиновая кислота

Пантотеновая кислота

Рибофлавин

Пиридоксин

Холинхлорид

Фолиевая кислота

Парааминобензойная

0,1

0,05

0,05

6000,0

600,0

1000,0

1000,0

20000,0

Испытуемые концентрации комОпыт

II O H F Í Ò Î Â

l Ч

Минималь- Оптималь- Максимальные ные ные кислота

Биотин

Цианкобаламин

Глюкоза

Целлобиоза

Крахмал

Мочевина

Агар-агар

Натрий серноватисток;.слый 250,0

Натрий сернокислый 250,0

Натрий двууглекислый 400,0

Дистиллированная вода Остальное

Отношение мочевины к углеводам в среде составляет 1:5-10.

Берут 5 мл полученной среды и засевают содержимым рубца, разведенным в растворе в количестве 0,5 мл.

Результаты по учету численности микроорганизмов, выросших на предлагаемой среде, представлены в табл. 1 (в содержимом рубца у коров).

Т а б л и ц а 1

225,0

225,0

445,0

45,0

45,0

20,0

20,0

2,0

2,0

2,0

1000> 0

500,0

200,0

20,0

20,0

20,0 однозамещенный

Калий фосфорнокислый двузамещенный

Натрий хлористый

Магний сернокислый

Кальций хлористый

Марганец сернокислый

Железо сернокислое

Цинк сернокислый

Медь ссрнокислая

Кобальт хлористый

Резазурин 0,17-ный раствор

Натрий уксуснокислый

Натрий лимоннокислый

Натрий валериановокислый

Натрий изовалериановокислый

Натрий изомаслянокислый

Количество микроорганизмов, млн/мл

4,93+0>23 5,30+0,63 4,87 0,42

4, 43+ 0 > 3 2 4 > 9 7 4.0, 5 9 4, 5 3+ 0, 45

5,97г 0,71 6,31 0,35 5,70+0,96

О чувствительности предлагаемой среды судят по числу выросших на ней колоний (табл. 2).

Результаты сравнительной оценки эффективности исследований численности микроорганизмов при культивировании на испытуемых средах приведены в табл. 2.!

30695!

2,0

2,0

2,0

Таблица2

Среда

Опыт исло

1000,0

500,0

200,0 икроорганизов, 7. к контучинского Предлагаемая (контроль) 20,0 оличество микроорганизов, млн/мл ролю

1О

20,0

20,0

2,0

2,0

2,0

2,0

2,0

2,0

0,5

1 4,70+0,48 5,30+0,63 113

2 4, 33+0, 35 4, 97 О, 59 .115

3 6,001.0,06 6,31+0,35 105

Из табл. 2 видно, что с помощью 20 предлагаемой среды удается выделять на 5-157 больше бактерий, использующих азот мочевины, чем на среде, взятой за прототип, т.е. эта среда более полно удовлетворяет потребности ука25 занных микроорганизмов в стимулято0,1

0,05

0,05

6000,0

600,0

1000,0

1000,0 рах роста.

Пример 1. Выращивание микроорганизмов, усваивающих азот мочевины, проводят в анаэробных условиях при 39 С в течение 24 ч. Готовят среду следующего состава, мг/л:

Калий фосфорнокислый однозамещенный 225,0

Калий фосфорнокислый двузамещенный 225,0

Натрий хлористый 445, О

Магний сернокислый 45,0

Кальций хлористый 45,0

Марганец сернокислый 20,0 40

Железо сернокислое 20,0

Таблица 3

Опыт 2

Опыт 1

Опыт 3

Показатели

Среды

Известная Предлагаемая Известная Предл агаемая Известная Предлагаемая

Амилазная активность, ед/мл

2,58 0,31 27,99 1,67 2,15+0,83 24,5 2,08 4,43+0,85 31,32 2,66

34,7 3,38 49,7+1,83 34,3«,87 50,1 -,,95 36,2 1,54 48,9 3,71

Углез, ды:

9 7+О, 77 5,ьт0 34

38,3+4,0 27,9й3,71

48 0 33,5 растворимые

41,0+2,99 28,3t1,25

37, I -3, IS 29,8- 2,07 легкогидролнзуемые

Всего

48,8

34,0

46,0 35,2 лимическ гл состав б омассы, г/100 г сухого всдества:

Белок

Цинк сернокислый

Медь сернокислая

Кобальт хлористый

Резазурин О, 17.-ный раствор

Натрий уксуснокислый

Натрий лимоннокислый

Натрий валериановокислый

Натрий изовалериановокислый

Натрий изомаслянокислый

Тиамин солянокислый

Никотиновая кислота

Пантотеновая кислота

Рибофлавин

Пиридоксин

Холинхлорид

Фолиевая кислота

Парааминобензойная кислота

Биотин

Цианкобаламин

Глюкоза

Целлобиоза

Крахмал

Мочевина

Натрий серноватистокислый 250,0

Натрий сернокислый 250,0

Натрий двууглекислый 400,0

Дистиллированная вода До 1 л

Контролем служит известная по прототипу жидкая синтетическая среда.

Амилазная активность и химический состав биомассы при культивировании ассоциации микроорганизмов рубца на испытуемых средах при разной деградируемости протеина приведены в табл. 3.

7,8+0,63 5, 7ь0,53 8,9+0,68 5, 0, 7

1306951

Т а б л и ц а 4

Концентрация мочевины в среде, мг/л

Лактат, мгЕ

Отношение мочевина

Амилазная акрН

Биомасса, ед

ОП тивность, ед/мл крахмал

38, 1 1,5

41, 6+1,3

39, 9+1, 1

1:20

9,9

5,6

100

1: t0

10,6

200

1:5

5,4

300

1:3,3

1:2,5

39 44.1,7

10,1

5,5

400

35,6 1,3

30,2+0,9

20,4+1,3

9,8

5,6

500

1:2

8,7

5,7

0,26 0,01

1000

7,8

5,8

Из табл. 3 видно, что при выращивании микроорганизмов рубца на предлагаемой среде их амилазная активность в 7-12 раз выше, чем при выращивании на известной среде.

Изучение химического состава микробных препаратов показало, что со— держание протеина в биомассе бактерий, выращенных на известной среде, было на 35-467. ниже, а углеводов на

31-43Х выше, чем при культивировании на предлагаемой среде, что объясняется наличием значительного количества неиспользованного крахмала в известной среде.

Пример 2. С целью доказатель— ства воздействия на жизнедеятельность чистых культур амилолитических стрептококков Streptococcus bovis, выделенных на предлагаемой среде, таких факторов, как соотношение мочевины и крахмала в среде, был проведен специальный опыт. Для этого культуры, обладающие амилолитической активностью, выращенные на предлагаемой среде, пересевают на жидкую среду с крахмалом. При этом концентрация крахмала в питательной среде постоянна (1000 мг/л), а количество мочевины увеличивают от 50 до 1000 мг/л (табл. 4).

Таким образом, получают соотношения мочевины к крахмалу от 1:20 до 1: l.

В качестве посевного материала служила суточная культура бактерий Str

bovis которую вносят в среду из расчета 27 к ее объему и инкубируют в о анаэробных условиях при 39 С.

Интенсивность роста культур контролируют на ФЭК-56М при длине волны

630 нм и выражают в единицах оптической плотности, 10 Исследованиями установлено, что по мере,цобавления к питательной среде мочевины происходит увеличение накопления биомассы стрептококков. Наибольшее накопление бактериальной

15 массы отмечено при соотношении мочевины к крахмалу в пределах 1:5-10.

Эти оптимальные соотношения мочевины к крахмалу в питательной среде обусловливают не только максималь ное на20 копление биомассы, но и повышенный синтез амилазы бактериями. Дальнейшее увеличение мочевины подавляло биосинтетическую и ферментативную активность микробов. Следовательно, среда, имеющая более широкое отношение мочевины к крахмалу, чем 1:5-10, не в полной мере обеспечивает потребность стрегтококков в азоте, а среда с более узким соотношением создает

30 избыток в азоте, и использование его снижается, Влияние соотношения в среде мочевины к крахмалу на накопление биомассы и амилазнjlo s rHsHoc Str. bovis

35 показано в табл. 4.

С,44+0,02

0,5340,02

0,50 0,01

0,46 0,02

0,424 0,01

0,39 0,02

1306951

200-250

200-250

400-500

40-50

40-50

15-25

15-25

1,5 — 2,5

1,5 — 2,5

1,5-2,5

800-1200

450-550

150-250

15-25

15 — 25

15-25

1,5-2,5

1,5-2,5

1,5-2,5

1,5-2,5

1,5-2,5

1,5-2,5 ,25-0,75

0,05-0, 15

0,025 вЂ,075

0,025-0,075

3500-8500

250-950

500-1500

800-1200

18000-22000 кислота

Биотин

Цианкобаламин

Глюкоза

Целлобиоза

Крахмал

Мочевина

Агар-агар

Натрий серноватистокислый 200-300

Натрий сернокислый 200-300

Натрий углекислый 350-450

Дистиллированная вода Остальное

Составитель И.Привалова

Редактор М.Бандура Техред А.Кравчук Корректор И.Муска

Заказ 1497/23 Тираж 500 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г.Ужгород, ул.Проектная, 4

Преимущества предлагаемой питательной среды в том, что Она более полно удовлетворяет потребности рубцовых микроорганизмов, усваивающих азот небелковых соединений, в стимуляторах роста при отношении мочевины к углеводам в пределах 1:5-10, что способ— ствует ускорению их роста на 5-15Х и повышению амилазной активности в 712 раз по сравнению с прототипом, за fQ счет чего обеспечивается повышение чувствительности и точности обнаружения.

Предлагаемая среда. дает возможность получить объективную оценку 15 вклада микроорганизмов, использующих азот мочевины, в аминокислотное и протеиновое питание жвачных животных.

Применение этой среды позволит глубже изучить закономерности течения микробиологических процессов в преджелудках жвачных животных с целью повышения эффективности использования питательных веществ рациона.

Формула изобретения

Питательная среда для обнаружения микроорганизмов рубца, усваивающих азот мочевины, содержащая углеводы — 30 глюкозу, крахмал, целлобиозу, минеральные соли — натрий уксуснокислый, натрий лимоннокислый, натрий валериановокислый, натрий изовалериановокислый, калий фосфорнокислый Однозамещенный, калий фосфорнокислый двузамещенный, натрий хлористый, марганец сернокислый, кальций хлористый, магний сернокислый, железо сернокислое, медь сернокислая, цинк сернокислый, 40 кобальт хлористый, натрий углекислый, натрий сернокислый, натрий серноватистокислый, резазурин, тиамин солянокислый, никотиновую кислоту, пантотеновую кислоту, рибофлавин, пиридок- 45 син, фолиевую кислоту, парааминобензойную кислоту, биотин, агар-агар, мочевину и дистиллированную воду, отличающаяся тем, что, с целью повышения чувствительности среды и точности выделения Она дополни тельно содержит в качестве стимуляторОВ роста натрий иэомаслянокислый, холинхлорид и цианкобаламин, а соотношение мочевины к углеводам устанавливают 1:5-10 при следующем соотношении компонентов, мг/л:

Калий фосфорнокислый однозамещенный

Калий фосфорнокислый двузамещенный

Натрий хлористый

Магний сернокислый

Кальций хлористый

Марганец сернокислый

Железо сернокислое

Цинк сернокислый

Медь сернокислая

Кобальт хлористый

Резазурин

Натрий уксуснокислый

Натрий лимоннокислый

Натрий валериановокислый

Натрий изовалериановокислый

Натрий изомаслянокислый

Тиамин солянокислый

Никотиновая кислота

Пантотеновая кислота

Рибофлавин

Пиридоксин

Холинхлорид

Фолиевая кислота 0

Парааминобензойная