Способ очистки препарата гистона н4 из ткани тимуса

 

Изобретение относится к молекулярной биологии, к способам получения и очистки основных белков хроматина гистонов. Цель изобретения повышение степени очистки целевого продукта путем предотвращения его протеолитической деградации в процессе хроматографии. Для этого образец суммарного гистона сернокислого из тимуса теленка растворяют в HC1, по каплям добавляют хлорную кислоту до конечной концентрации 0,5 М. При этом образуется осадок нерастворимых гистонов H2A, H2B,H3, H4. Его отделяют центрифугированием от растворимого в хлорной кислоте гистона H1. Образец, содержащий гистоны H2A, H2B, H3, H4, растворяют в растворе, состоящем из 0,02 H.HC1, 0,005M NaC1, pH 1,7. Проводят хроматографию при комнатной температуре на акрилексе II-30. Элюирование белка с колонки проводят исходным раствором. Регистрацию выхода белка с колонки ведут спектрофотометрически при длине волны 230. Белковые фракции, соответствующие каждому белковому пику, объединяют, диализируют против 0,01 0,02 н. HC1 при 4°С и лиофилизуют. Выход белка с колонки составляет 95% Полученный препарат обладает высокой бактерицидной активностью. 1 ил.

Изобретение относится к молекулярной биологии, в частности к способам получения и очистки основных белков хроматина гистонов. Гистоны используются в модельных экспериментах при исследовании механизма взаимодействия этих белков с дезоксирибонуклеиновой кислотой (ДНК) и негистоновыми белками в дезоксирибонуклеиновом комплексе (ДНП) или хроматине ядер тканей животных и растений, т. е. с целью изучения структуры хроматина, что является одной из основных проблем молекулярной биологии. Цель изобретения повышение степени очистки целевого продукта за счет предотвращения его протеолитической деградации в процессе хроматографии. Способ осуществляется следующим образом. Образец суммарного гистона сернокислого из тимуса теленка растворяют в 0,01-0,02 н. HCl. К раствору по каплям при перемешивании добавляют концентрированную хлорную кислоту до конечной концентрации 0,5 М. При этом образуется осадок нерастворимых в 0,5 М хлорной кислоте гистонов Н2А, Н2В, Н3, Н4, который отделяют от растворимого в хлорной кислоте гистона Н1 центрифугированием. Для полноты извлечения гистона Н1 осадок гистонхлоридов обрабатывают 0,5 М хлорной кислотой, взятой в 0,5-кратном объеме по отношению к объему исходного раствора. Осадок гистонхлоридов обрабатывают ацетоном, содержащем 0,02 н. серную кислоту и высушивают под вакуумом. Образец, содержащий гистоны Н2А, Н2В, Н3, Н4, растворяют в растворе следующего состава: 0,02 н. соляная кислота, 0,05 М натрий хлористый, рН 1,7. Белковый раствор подвергают хроматографическому разделению на акрилексе П-30 "Реанал, Венгрия). Хроматографию проводят при комнатной температуре. Используют колонку длиной 80-100 см и диаметром 2,0-2,5 см, в которую вносят образец из расчета 15-20 мг/см². Элюирование белка с колонки проводят исходным раствором. Скорость протекания буфера 6 мл/ч, объем фракций 3 мл. Регистрацию выхода белка с колонки осуществляют спектрофотометрически при длине волны 230 нм. Белковые фракции, соответствующие каждому белковому пику, объединяют, диализируют против 0,01-0,2 н. HCl при 4^оС и лиофилизируют. В результате хроматографического разделения на акрилексе П-30 смеси гистонов, лишенной гистона Н1, получают три белковых пика, которые содержат в своем составе следующие классы гистонов: пик 1 смесь гистонов Н2А+Н3, пик 2 гистон Н2В, пик 3 гистон Н4. Выход белка с колонки составляет 95% По данным электрофоретического анализа в полиакриламидном геле препарат гистона Н4 характеризуется 95-98% -ной гомогенностью. Отклонение молярных соотношений между классами гистонов по отношению к таковому в исходном препарате суммарного гистона не превышает 5-7% Полученный предлагаемым способом препарат гистона Н4 обладает высокой бактерицидной активностью, которая наблюдается при использовании его в концентрации 10-40 мкг на 1 мл бактериальной суспензии. П р и м е р 1. Образец суммарного гистона сернокислого (НПО "Биолар", номенклатурный N 040554) в количестве 100 мг растворяют в 20 мл 0,01 н, HCl. Раствор фильтруют через стеклянный фильтр Шотта N 1. К белковому раствору добавляют по каплям 43%-ную хлорную кислоту до конечной концентрации 0,5 М. Процедуру проводят при комнатной температуре и при постоянном перемешивании раствора на магнитной мешалке. Раствор оставляют на 10-15 мин для формирования осадка гистонхлоридов и центрифугируют. На этом этапе отделяют растворимый в 0,5 М хлорной кислоте гистон Н1. Для полноты извлечения гистона Н1 осадок гистонхлоридов один-два раза обрабатывают раствором 0,5 М хлорной кислоты, взятой в 0,5-0,6-кратном объеме по отношению к объему исходного раствора. Осадок гистонхлоридов промывают 2-3 раза ацетоном, содержащем 0,01 н. HCl, и высушивают под вакуумом. Перед фракционированием образца, содержащего гистоны Н2А, Н2В, Н3, Н4, проводят электрофоретический анализ полученного препарата в полиакриламидном геле. Эту процедуру рекомендуется проводить для того, чтобы удостовериться в отсутствии протеиназной активности в препарате. Для этого образец растворяют в дистиллированной воде, 5М мочевине, 0,9 н. уксусной кислоте, буфере элюирования, рН 1,7, до конечной концентрации 1 мг/мл. Полученные растворы выдерживают при комнатной температуре в течение 48 ч, а другую серию идентичных растворов выдерживают при 37^оС в течение 3 ч. После окончания срока инкубации растворы для электрофоретического разделения в полиакриламидном геле обрабатывают мочевиной, уксусной кислотой, 2-меркаптоэтанолом до конечных концентраций 8 М, 0,9 н. 4% соответственно. В качестве эталона сравнения используют образец, который растворяют непосредственно перед проведением электрофореза в растворе 0,9 н. уксусной кислоты, содержащей 8 М мочевину, 4%-ный 2-меркаптоэтанол. Если после проведения электрофореза в полиакриламидном геле ни в одном из анализируемых образцов не обнаруживается продуктов деградации гистонов (на что указывает отсутствие дополнительных белковых зон на электрофореграммах между фракциями гистонов Н2А и Н4, а также впереди гистона Н4), исходный препарат можно использовать, для хроматографического разделения на акрилексе П-30. В случае отсутствия протеиназной активности 75 мг образца растворяют в 5 мл раствора следующего состава: 0,015 н.HCl, 0,05 М натрий хлористый, рН 1,7. Белковый раствор вносят в колонку, заполненную гелем акрилекс П-30, предварительно уравновешенную исходным раствором. Для хроматографического разделения используют колонку длиной 94 см и диаметром 2,5 см. Элюирование белка с колонки проводят исходным раствором. Скорость протекания буфера составляет 6 мл/ч, объем фракций 3 мл. Хроматографию проводят при комнатной температуре. Регистрацию выхода белка с колонки осуществляют спектрофотометрически при длине волны 230 нм на основании этих данных строят профиль элюции белка с колонки. Получают три белковых пика: пик 1 смесь гистонов Н2А + +Н3, пик 2 гистон Н2В, пик 3 гистон Н4. Диализ белкового пика 3 проводят при 4^оС против 40-50 объемов 0,015 н. HCl в течение 20 ч при смене раствора через каждые 5-6 ч. После диализа проводят лиофилизацию белка. Общий выход белка с колонки акрилекс П-30 составляет 95% Если выход гистона Н4 условно принять за единицу, то молярное соотношение между классами гистонов будет равно 1,50:1,03:1,03:1,00 для гистонов Н2В:H2A:H3:H4 соответственно. На чертеже представлен профиль хроматографического разделения препарата суммарного гистона тимуса телят, предварительно лишенного гистона Н1. П р и м е р 2. Очистку гистона Н4 проводят так же, как в примере 1 за исключением того, что используют 0,01 н.HCl при диализе. Профили хроматографического разделения препарата суммарного гистона, лишенного гистона Н1, на колонке акрилекс П-30 и результаты электрофоретического анализа конечного продукта идентичны при использовании для растворения и диализа как 0,015 н. так и 0,01 н. HCl. П р и м е р 3. Очистку гистона Н4 проводят так же, как в примере 1, за исключением того, что при растворении и диализе используют 0,02 н. HCl. Выход и степень очистки гистона Н4 не отличаются от таковых в примере 1. При интервале значений концентрации раствора 0,01-0,02 н.HCl, против которого ведут диализ конечного продукта, растворимость гистона Н4 максимальна. При этих концентрациях соляной кислоты гистон Н4 не агрегирует (не выпадает в осадок). С другой стороны, проведение лиофилизации при столь низких концентрациях соляной кислоты не может вызвать частичного гидролиза белка.

Формула изобретения

СПОСОБ ОЧИСТКИ ПРЕПАРАТА ГИСТОНА Н4 ИЗ ТКАНИ ТИМУСА путем растворения препарата суммарного гистона сернокислого из тимуса телят в соляной кислоте, хроматографического отделения гистона Н4, диализа и лиофилизации, отличающийся тем, что, с целью повышения степени очистки целевого продукта за счет предотвращения его протеолитической деградации, растворенный гистон обрабатывают 0,5М раствором хлорной кислоты, полученный осадок обрабатывают ацетоном, затем растворяют его и проводят хроматографическое отделение целевого продукта на акрилексе П-30, а диализ осуществляют против 0,01 0,02 н. раствора соляной кислоты.

РИСУНКИ

Рисунок 1