Способ определения молочной кислоты в биологических жидкостях

 

Изобретение относится к медицине . Цель изобретения - повышение точности способа. Смешивают раствор сульфосалициловой кислоты и исследуемую биологическую жидкость и центрифугируют . Супернатант помещают в водяную .баню, смешивают с рабочим реактивом и нагревают.Полученную смесь смешивают с раствором параоксидифенила,прогревают , охлаждают и фотометрируют. Количество молочной кислоты в опытной пробе высчитывают с учетом оптической плотности эталонной пробы с известной концентрацией молочной кислоты.2 табл. 00 со ел 00 00

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАИИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН (19) (ll) А1

yl) 4 G 01 N 33/66

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ,13

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ CCCP

flO ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3906693/28-14 (22) 06.06.85 (46) 07.09,87. Бюл. Ф 33 (71) Белорусский научно-исследова-. тельский институт охраны материнства и детства (72) В.Ю. Домбровский и В,П, Панферов (53) 616.7(088.8) (56) Руководство по клиническим лабораторным исследованиям.. M., 1964, с. 294. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МОЛОЧНОЙ КИС-.

ЛОТЫ В БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЯХ (57) Изобретение относится к медицине, Цель изобретения — повышение точности способа. Смешивают раствор сульфосалициловой кислоты и исследуемую биологическую жидкость и центрифугируют. Супернатант помещают в водяную .баню, смешивают с рабочим реактивом и нагревают. Полученную смесь смешивают с раствором параоксидифенила, прогревают, охлаждают и фотометрируют. Количество молочной кислоты в опытной пробе высчитывают с учетом оптической плотности эталонной пробы с известной концентрацией молочной кислоты.2 табл.

I 1335880 2

Изобретение относится к биологии и медицине и может быть использовано в клинической лабораторной диагностике.

Цель изобретения — повышение точности способа за счет внесения в супернатант соляно-кислого семикарбазида.

Способ осуществляется следующим )p образом, Применяют реактивы: 0,229 моль/л (57) водный раствор сульфосалициловой кислоты; серная кислота для пробы Са валя; 0,500 моль/л (12,57) водный 16 раствор серно-кислой пятиводной меди)", 0,179 моль/л (27) водный раствор с.оляно-кислого семикарбазида.

Рабочий реактив получают следующим образом. К 99,0 мл серной кислоты для 20 прсбы Саваля добавляют 0,6 мл

0,500 моль/.л раствора серно-кислой меди, перемешивают и добавляют 0,4 мл

0,179 моль,/л раствора соляно-кислого семпкароазида. Перемешивают и ставят ?б а в водяную баню с температурой 70 С на 30 мин, после чего реактив вынимают из бани и охлаждают до комнатной темперагуры.

Кроме того, применяют 0,088 моль/л 30 (1,5i) раствор параоксидифенила в диметилформамиде.

В пробирку наливают 0.,4 мл

0,229 моль/л раствора сульфосалициловой кислоты, вносят в нее 0,02 мл цельной крови (плазмы крови, сыворотки крови, спинно-мозговой жидкости), тщательно перемешивают и через 10 мин центрифугируют в течение 10 мин при

3000 об./мин. 0,3 мл супернатанта пе- 40 реносят в другую пробирку, которую помещают в холодную водяную баню с темо пературой воды 5-15 С, после чего в нее добавляют 2,6 мл рабочего реактива, тщательно перемешивают и прогревают в водяной бане с температурой о воды 70 С в течение 10 мин. Пробирку охлаждают водопроводной водой,,цобавляют в нее 0,05 мл 0,088 моль/л раствора параоксидифенила, тщательно перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 60 мин, Пробу вновь прогревают в водяной

D бане с температурой воды 70 С в течение 4 мин, охлаждают водопроводной водой до комнатной температуры и фотометрируют на спектрофотометре при

570 нм против контроля на реактивы в кювете с толщиной рабочего слоя

10 Mhi ° Контрольную пробу обрабатывают так же, как и опытную, но вместо исследуемой биологической жидкости используют дистиллированную воду в том же объеме.

Количество молочной кислоты в опытной пробе высчитывают с учетом оптической плотности эталонной пробы с известной концентрацией молочной кислоты, которую также проводят через всю методику, Расчет ведут по формуле

-эт где С и С вЂ” концентрации молочной

an кислоты в опытной и эта онной пробах соствстственно;

Е и Е, — оптические плотности

all опытной и эталонной пробы соответственно.

Повьппение точности определения молочной кислоты по предлагаемому способу по сравнению с известным способом подтверждается при экспериментальком исследовании растворов молочной кислоты с концентрациями 0,555;

1,110 и 2„220 ммоль/л,цельной крови, плазмы крови и с.пинно-мозговой жидкости, результаты которого представлены в табл. 1, Проводят по 5 параллельных определений каждой пробы, Сравнительный анализ результатов статистической обработки величин оптической плотности цветного продукта реакции при определении .молочной кислоты по предлагаемому и известному способам показывает, что в ;-.ервом случае при больпем значении средней арифметической (М) величины средней ошибки средней арифметической (ш) и среднеквадратического отклонения (б ) значительно ниже, чем при определении молочной кислоть.. по известному способу, что свидетельствует о большей точности предлагаемого способа.

П р и и е р 1. Определение молочной кислоты проводят в отдельных пробах цельной крови, плазмы крови,сыворотки крови, спинно-мозговой жидкости и эталонного раствора молочной кислоты, причем из каждой пробы делают по три параллельных определения и рассчитывали M„ m и б

В шестна,ццать пробирок наливают по 0,4 мл 0,229 моль/л раствора сульфосалициловой кислоты и вносят в пробирки 1-3 по 0,02 мл цельной кро1335880 ви, в пробирки 4-6 0,02 мл плазмы крови, в пробирки 7-9 0,02 мл сыворотки крови, в пробирки 10-12 0,02 мл спинно-мозговой жидкости в пробирки ь

13-!5 0,02 мл эталонного раствора молочной кислоты с концентрацией

1 ммоль/л в пробирку 16 0,02 мл дистиллированной воды (контроль на реактивы), Пробы тщательно перемешивают и через 10 мин центрифугируют в течение

10 мин при 3000 об/мин. 0,3 мл супернатанта из каждой пробирки переносят в другие пробирки с соответствующими номерами, которые помещают в водяную баню с температурой воды 5-15 С,после чего в них добавляют по 2.,6 мл рабочего реактива Гс испо:и зоваппем

0,6 мл 0,480 моль/л сег,но-кислой цятиводной меди + 0,4 мл 0,170 моль/л соляно-кислой семикарбазида + серной кислоты для пробы Саваля до 100).

Пробы тщательно перемешивают и прогревают в водяной бане с температу- 2В рой воды /О С в течение 10 мин, после чего охлаждают водопроводной водой, добавляют в них по 0,05 мл

0,088 моль/л раствора параоксидифенила, тщательно перемешивают и остав- g0 ляют при комнатной температуре на

60 мин, Затем пробы вновь прогревают в водяной бане с температурой воды о

70 С в течение 4 мин, охлаждают водопроводной водой до комнатной темпера35 туры и фотометрируют опытные и эталонную пробы на спектрофотометре при

570 нм против контроля на реактивы.

Количество молочной кислоты в опыт-<< ных пробах высчитывают по формуле (1)

Получают следующие Результаты измерения оптической плотности опытных и эталонных проб Еоо, = 0,187; Ео„

Средняя Е „,, = 0,230. По Формуле О (1) рассчитывают концентрацию молочной кислоты в опытных пробах

0 813 ммоль/л;

С, = 0,800 ммоль/л;

С„,э = 0,808 ммоль/л.

Таким образом, для пробы цельной крови

М = 0,807; тп = +0,0046;

С = 0,0065.

0,978 ммоль/л;

0,987 ммоль/л; — 0,969 ммоль/л.

Соп

СО 5

С„, Для пробы плазмы крови

М = 0,978; п7 — +0,0063;

0,0090. — 1 . 1 65 MMOJTb/ U

l, 156 ммоль/л;

1,148 ммоль/л, 0П7 pnS

Con 9

Для пробы сыворотки крови

1сб

+0 0060

0,0085.

1,595 ммоль/л;

1,578 ммоль/л; — 1,587 ммоль/л. бы спинно-мозговой жидкости

m,0

Can

Con

Для про

N = 1,586;

m = +0,0060;

6 = 0,0085.

С „ = 0,818 ммоль/л;

В тех же образцах цельной крови, плазмы крови, сыворотки крови и спинно-мозговой жидкости (по три параллельных определения из каждой пробы) способом, описанным в примере 1, но с использовавием рабочего реактива с максимальными значениями концентраций меди сернокислой пятиводной и семикарбазида солянокислого (0,6 мл

0,520 моль/л серно-кислой пятиводной меди + 0,4 мл С,201 моль/л солянокислого семикарбазида + серная кислота для пробы Саваля до 100,0 мл), определяют кочичество молочной кислоты.

Получают следующие практические результаты измерения оптической плотности опытных и эталонной проб: E „<

pnz y 8 j Eppes

Fpn7 (сыворотка кРови) = 0,268; Е „8

По формуле (1) рассчитывают концентрацию молочной кислоты в опытных . пробах

1335880

Таким образом, для пробы цельной крови

0,810;

+Оь0047ь

0,0066.

0,965 ммоль/л;

0,974 ммоль/л;

0,978 ммоль/л.

ОП4

Соп

Caï6

15 ммоль/л; ммоль/ль ммоль/ле

1,160

1, 169 — 1, 15.1 опт опт

anal 9

Для пробы сыворотки крови

М = 1,160, m = +0 0063;

Б = 0,009.

25 l,588 ммоль/л;

1,575 ммоль/л;

0,575 ммоль/л, 0gp ig =

Con „ оп

Для пробы спинно-мозговой жидкости

М = 1,579," ш = +0,0053; (з = 0,0075.

0,17-0,20

Результаты определения молочной 35 кислоты в одних и тех же пробах биолоДо 100

Таблица 1

Оптическая плотность по способу

Исследуемый материал

По предлагаемому способу

Раствор молочной кислоты

0,125

0,130

Оь127

0,131

0,128

О,?60

0,257

0,258

0,254

0,255

Оь070 M = 0,079

0,128

0,090

0,060

m = +0,0067

+0,0011

0,0024

Оь555 ммоль/л

0,095 G = 0,0149

Оь080

0,163

0,192 М = 0,174

То же, ,110 ммоль/л

0,257

+0,0011

0,0024

Оь 1 ФО

0,200

0,174

m = +0,0115

0,0257

С„„ = 0,809 ммоль/л;

С„„ = 0,805 ммоль/л.

Для пробы плазмы крови

М = 0;972;

m = +Оь0047;

C) = 0,0066. гических жидкостей с использованием рабочего реактива с минимальными и максимальными значениями концентраций серно-кислой пятиводной меди и солянокислого семикарбазида представлены в табл. 2.

Сравнительный анализ с использованием статистическсй обработки не выявил различий между ними.

Формула изобретения

Способ определения молочной кислоты в биологических жидкостях путем добавления в пробу химического реактива, центрифугирования полученной смеси с последующим внесением в супернатант раствора серно-кислой пятиводной меди и серной кислоты. для пробы Саваля, нагревания, а затем охлаждения и добавления в пробу раствора параоксидифенила, после чего проводят спектрофотометрическое измерение, о т л и ч а ю ш, и и с я тем, что, с целью повышения точности способа, в супернатант дополнительно вносят соляно-кислый семикарбазид в смеси с реактивами при следующем соотношении компонентов, моль/л:

Серно-кислая пятиводная медь 0,48-0,52

Семикарбазид солянокислый

Серная кислота для пробы Саваля

По известному способу

1335880

Продолжение табл,1

Оптическая плотность по способу

Исследуемый материал

По предлагаемому способу

По известному способу

0,512 M = 0,514

0,330

0,370

0,354

0,302

0,333

То же, 2,220 ммоль/л

+О, 0135

0,0302

+0,00 13

0,0029

0,310

0,068 М = 0,091

0,158

Цельная кровь

0,073

0,102

0,117

+0,0094

0,0210

+0,0011

0,0024

0,094

0,158 М = 0,161

0,247

Плазма крови

0,192

0,137

0,178

+0,0108

0,0237 .

+0 0012

0,0026

О, 143

0,210 М = 0,219

0,436

Спинно-мозговая жидкость

0,190

0,265

0 234

0,196

m = +0,0144

+0,0026

0,0058

0,0322

Т а б л и ц а 2

Концентрация молочной кислоты (M+m) при использовании рабочего реактива,ммоль/л,с значениями концентраций меди сернокислой пятиводной и семикарбазида соляно-кислого

Биологическая жидПроба кость (t = 0,45) - 0,1 (t = 0,76) r 0,1

0,807+0,0046 0,810+0,0047

1-3

Цельная кровь

0,978+0,0063 0,972+0,0047

4-6

Плазма крови

1,156+0,0060 1,160+0,0063 (t = 0,46) > 0,1

7-9

Сыворотка крови (t = 0,87) О,1

1, 586+0,0060 1, 579+0, 0053

10-12

Спинно-мозговая жипкость

0,517

0.515

0,513

0,516

0,160

О, 157

0,155

0,160

0,161

0,245

0,248

0,250

0,247

0,246

0,435

0,433

0,439

0,440

0,437 минимальными максимальными,