Штамм гетероплоидных клеток почки теленка таурус-1, используемый для культивирования вирусов

 

Изобретение относится к вирусологии и может быть использовано для получения вируссодержащего материала не клеточных субстратах. Целью изобретения является получение нового клеточного штамма почки теленка, чувствительного к широкому спектру вирусов. Данный штамм получен из клеток почки теленка путем трипсинизации измельченных кусочков органов и адаптации полученной клеточной взвеси к росту in vitro. Он хранится в коллекции клеточных культур ВНИИгриппа Минздрава СССР под номером ВСКК (ДП) N 002.

Изобретение относится к области вирусологии и может быть использовано для получения вируссодержащего материала на клеточных субстратах. Цель изобретения получение нового клеточного штамма почки теленка, чувствительного к широкому спектру вирусов. Данный штамм получен из клеток почки теленка путем трипсинизации измельченных кусочков органов и адаптации полученной клеточной взвеси к росту in vitro. Он хранится в коллекции клеточных культур ВНИИ гриппа Минздрава СССР под номером ВСКК(ДП) N 002. Штамм гетероплоидных клеток почки теленка характеризуется следующими признаками. Морфологические признаки. В первичной культуре и в перевиваемой до 6-7 пассажа отмечается органотипический рост: островки эпителиодных клеток (ЭК) чередуются с тяжами, состоящими из фибробластоподобных клеток (ФК). Оба вида клеток занимают примерно равную площадь. В процессе дальнейших перевивок количество ЭК постепенно увеличивается, а ФК уменьшается. Смешанный клеточный состав в разных культурах сохраняется до 25-27 пассажа. Только после дробной обработки трипсином получается однородная культура ЭК. На фиксированных и окрашенных препаратах культуры 34-99 пассажей установлено, что клеточный пласт на 3-4 день инкубации состоит из тесно прилегающих друг к другу полигональных клеток с четко выраженными границами. При электронно-микроскопическом излучении штамма Таурус-1 на уровне 69 пассажа было установлено, что культура представлена клетками эпителиоидного типа, которые имеют овальную или слегка вытянутую форму с крупным центрально расположенным ядром. По периферии ядра четко выражен ободок пристеночно расположенного хроматина. Контуры ядра ровные, но иногда наблюдают инвагинацию ядерной мембраны. В цитоплазме обнаруживают относительно крупные митохондрии со слабоконтрастным матриксом и небольшим количеством крист, расширенные канальцы зернистой эндоплазматической сети и хорошо развитый комплекс Гольджи. Кариологические признаки. На уровне 65 пассажа установлена гетероплоидность штамма Таурус-1. Модальное число хромосом 57 (74%). Анеуплоидные клетки составили 24% Все 98% клеток содержат от одного до трех двуплечих маркеров; 2% клеток оказались тетраплоидными с четырьмя двуплечими маркерными хромосомами. Культуральные признаки. Штамм поддерживается на среде Игла МЕМ с 10% сыворотки крупного рогатого скота. Клетки инкубируют при 37^оС, кратность рассева 1:2; 1:3. Характерной особенностью клеток является их способность на уровне 1-40 пассажей сохраняться на стекле в жизнеспособном состоянии до 3 мес. без смены среды, а со сменой среды до 1 года. Количество клеток в монослое 1,5 матраса достигает 80-90 млн. Изоферментная характеристика. Клетки штамма обладают глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназной и лактатдегидрогеназной активностью, свойственной клеткам коровы. При обследовании клеток штамма Таурус-1 на стерильность (наличие грибов, бактерий, микоплазм) получены отрицательные результаты на уровнях 5, 8, 9, 15, 20, 27, 34, 40, 45, 55, 65, 7, 77, 81, 86, 89, 94, 100 пассажей. При исследовании культуральной жидкости и самих клеток на уровнях 8 и 75 пассажей в чувствительных клеточных системах, а также в реакциях гемадесорбции не выявлены вирусы-контаминанты. При обследовании клеток штамма Таурус-1 на тех же уровнях пассажей в опытах на взрослых и сосунках белых мышей, кроликах, морских свинках, а также клеток на уровнях 9 и 81 в опытах на куриных эмбрионах и иммунодепрессированных мышах линии СВА посторонних агентов, в том числе и онкогенных, не обнаружено. Клетки штамма Таурус-1 сохраняют жизнеспособность (не менее 85%) при консервировании в жидком азоте. Создан банк посевных клеток на уровне 65 пассажа в количестве 340 ампул по 10 млн в каждой. Этот пул клеток отконтролирован на безопасность. Штамм клеток почек теленка Таурус-1 чувствителен к заражению вирусами человека и животных. П р и м е р 1. Культивирование вируса гриппа А. В матрасы объемом 1 л с монослоем клеток штамма Таурус-1 на уровне 90 пассажа вносят смесь растворов 0,25%-ного трипсина и 0,02%-ного версена в количестве 20 мл. Легким покачиванием ополаскивают монослой, и раствор сливают. Через 5-10 мин в матрас вносят 5-10 мл ростовой среды, и клетки тщательно пипетируют. Определяют количество клеток и разводят средой до посевной концентрации: 100 тыс. клеток в 1,0 мл для стационарного культивирования; 150 тыс. клеток в 1 мл при культивировании в пробирках и в роллерных флаконах. В качестве среды роста используют среду Игла с 10% сыворотки телят. Суспензию клеток разливают по пробиркам, матрасам объемом 1 л, роллером объемом 3,0 или 5,0 л и культивируют при 37^оС в течение 48-72 ч до образования монослоя. Полученную культуру отмывают раствором Хенкса или фосфатно-солевым буфером (рН 7,2-7,4) от ростовой среды, после чего используют для накопления вируса или титрования его инфекционной активности на пробирках. Для накопления вируса гриппа А (Ленинград) 385/80 в монослойную культуру, выращенную на роллерных флаконах объемом 3,0 и 5,0 л вносят 5,0-7,0 мл инфекционного вируса в концентрации 6,0-7,0 lg ТЦД₅₀/мл. Адсорбцию вируса проводят в течение часа, затем вносят поддерживающую среду. Культуры инкубируют при 37^оС. Через 5-7 сут после заражения развиваются цитопатические изменения. Уровень накопления вируса определяют по его инфекционному титру и гемагглютинирующей активности. Инфекционный титр определяют путем титрования вируссо- держащей жидкости на 10-11-дневных куриных эмбрионах. Уровень гемагглютинирующей активности вируса определяют в реакции гемагглютинации с 1% -ной взвесью свежеприготовленных куриных эритроцитов и выражают величиной, обратной наибольшему разведению, вызывающему их агглютинацию. Инфекционный титр вируса гриппа А, репродуцированного на клетках штамма Таурус-1, равен 8,5 lg ТЦД₅₀/мл, тогда как его гемагглютинирующая активность соответственно составляет 1:64 ед. П р и м е р 2. Культивирование аденовируса человека. Для размножения аденовирусов 1-7 типов в монослойную культуру клеток штамма Таурус-1, выращенную на матрасах или роллерных бутылях, как описано в примере 1, вносят 3,0-5,0 мл инфекционного вируса в концентрации 5,0 lg ТЦД₅₀/мл. Адсорбцию проводят в течение получаса, затем вносят поддерживающую среду (среда Игла без сыворотки). Культуры инкубируют в течение 6-7 дней с ежедневным просмотром под малым увеличением микроскопа. Цитопатический эффект развивается под действием всех типов аденовируса, кроме 5. Уровень вирусной репродукции определяют в параллельном титровании зараженных материалов на пробирочной культуре клеток штамма Таурус-1 и в сравнении с линией Нер-2. Учет результатов проводят по цитопатическому эффекту, который наступает на 8-10 день. Инфекционный титр на клетках штамма Таурус-1 аденовирусов 1, 2, 3, 4, 6, 7 типов равен 4,0-6,5 lg ТЦД₅₀/мл, на линии Нер-2 соответственно 5,0-67,0 lg ТЦД₅₀/мл (а по типам следующие: 1 6,5 и 7,0; 2 6,0 и 7,0; 3 5,2 и 5,0; 4 5,0 и 7,0; 6 6,0 и 7,0; 7 4,0 и 7,0). П р и м е р 3. Способ культивирования вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота. В культуральный сосуд с клетками штамма Таурус-1 на уровне 95 пассажа вводят 0,25%-ный раствор трипсина, подогретого до 37^оС. Через 1-1,5 мин раствор удаляют, а сосуд с клетками помещают в термостат при температуре 37^оС на 2-3 мин. После этого в него вносят небольшое количество питательной среды и энергичным встряхиванием заканчивают процесс отделения клеток от стекла. Затем готовят клеточную взвесь в среде Игла МЕМ с 10% СКРС и эксплантируют в пробирки по 1 мл, содержащие 200 тыс. клеток. Культуры инкубируют при 37^оС в течение 3 сут до момента формирования монослоя. При заражении вирусом (изолят 4016) среду из пробирок удаляют, клетки однократно промывают раствором Хенкса и вводят 0,2 мл вируссодержащей жидкости из расчета 1 ТЦД₅₀/мл на клетку. Адсорбцию вируса проводят в течение 1 ч при 37^оС. Затем добавляют 1 мл той же среды без сыворотки. Культуры инкубируют при 37^оС. Сбор вируса проводят на 5-6 сут. Титр вируса определяют по развитию цитопатического эффекта. Титр вируса 6,5 lg ТЦД₅₀/мл. П р и м е р 4. Способ культивирования аденовируса крупного рогатого скота. Клетки штамма Таурус-1 на уровне пассажа готовят к заражению вирусом, по способу, описанному в примере 3. Вводят вирусы (изоляты Русь 18/81 и Москва 3056) из расчета 0,03 ТЦД₅₀/мл на клетку. Сбор вируса проводят через 12 сут. Титр вируса для обоих изолятов равен 5,5 lg ТЦД₅₀/мл.

Формула изобретения

Штамм гетероплоидных клеток почки теленка Таурус-1 ВСКК(ДП) N 002 (коллекция культур клеток ВНИИ гриппа МЗ СССР), используемый для культивирования вирусов.

MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 28.09.2000

Номер и год публикации бюллетеня: 10-2004

Извещение опубликовано: 10.04.2004        

---