Способ получения суспензионных клеточных культур растений

 

Изобретение относится к сельскому хозяйству и может быть использовано в биотехнологии, селекцци и семеноводстве. Цель изобретения - ускорение процесса и повышение эффективности способа. Вычленяют у 20 видов растений эксплантаты , в качестве которых используют фрагменты проростков размером 1-3 мм. В питательную среду для культивирования вводят дополнительно железо серно-кислое в количестве 70 - 100 мг, натриевую соль этилендиаминтетрауксусной кислоты (Na ЭДТА) 90- 130 мг и 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту в количестве 4-8 мг на 1 л питательного раствора. В среды, не содержащие , его добавляют в количестве 200-300 мг/л. Полученные клеточные суспензии с плотностью до 1 -10 клеток/мл были размножены посредством пассирования на среды с уменьшенным до указанного в прописях содержанием железа серно-кислого и Na ЭДТА. При субкультивировании в течение 10 циклов выращивания суспензионные клеточные культуры сохраняли высокую жизнеспособность. 4 табл. (Л

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (191 (11) А1

-(5!) 4 А 01 Н 3/00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3840191/30-15 (22) 10.01. 85 (46) 15. 03. 88. Бюл. !(10 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт кормов им.В.P.Âèëüÿìñà (72) A.Â.Ìåçåíöåâ и С.И.Костенко (53) 58 1.143.6 (088.8) (56) Бутенко P.Ã. Культура изолированных тканей и физиология морфогенеза растений. M., 1964, с.73. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СУСПЕНЗИОННЫХ

КЛЕТОЧНЬ!Х КУЛЬТУР РАСТЕНИЙ (57) Изобретение относится к сельскому хозяйству и может быть использовано в биотехнологии, селекц)1и и семеноводстве. Цель изобретения — ускорение процесса и повьппение эффективности способа. Вычленяют у 20 видов растений эксплантаты, в качестве которых используют фрагменты проростков размером

1-3 мм. В питательную среду для куль- . тивирования вводят дополнительно железо серно-кислое в количестве 70

100 мг, натриевую соль этилендиаминтетрауксусной кислоты (Ма ЭДТА) 90130 мг и 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту в количестве 4-8 мг на 1 л питательного раствора. В среды, не содержащие ИН4ИОз, его добавляют в количестве 200-300 мг/л. Полученные клеточные суспензии с плотностью до

1 10 клеток/мл были размножены поб средством пассирования на среды с уменьшенным до указанного в прописях содержанием железа серно-кислого и

Na ЭДТА. При субкультивировании в течение 10 циклов выращивания суспенэионные клеточные культуры сохраняли высокую жизнеспособность. 4 табл. 1380688

Изобретение относится к сельскому хозяйству и может быть использовано в биотехнологии, селекции и семенонодстне, н исследонаниях по физиологии, фитопатологии и генетике растений.

Пель изобретения — ускорение процесса и повьппение эффективности способа. 10

Пример. Получают суспензионные клеточные культуры у 20 видов растений (пшеница, овес, кукуруза, рис, кострец, кленер, люцерна, эспарцет, горох, соя, фасоль, подсолнеч- 15 ник, гербера, картофель, табак, раис, сурепица, арбуз, тыква, морковь), относящихся к 7 семействам. Семена стерилизуют н 707-лом этаноле 2-3 мин и 5-7 мин в 0,17.-ном водном растворе 2р диоцида, затем 3-4 раза промынают стерильной дистиллированной водой и проращинают н чашках Петри на фильтровальной бумаге. Полученные проростки разрезают на фрагменты размером 25

1-3 мм и помещают н колбы емкостью

100 мл с 10 мл среды MS, В и SH мг/л

2,4-Д, содержащие 84 мг/л сернокислого железа (II) в 111 мг/л Nap 3 !ТА.

В среды В и Я! с низким содержани- 30 ем аммония (соответственно 35,6 и

Ф

47 мг/л NH4) 250 мг/л нитрата аммония (56,2 мг/л NH„). Плотность образовавшихся клеточных суспензий определяют н гемоцитометре.

Фукса-Розенталя, а их жизнеспособность — по методике Wid holm.

В течение первого цикла выращивания все используемые ниды растений образовали клеточные суспензии с

40 плотностью 31-680 тыс. клеток/мл и жизнеспособностью 75-937 (табл. 1).

Проведенные опыты показали, что среда с добавлением 200-300 мг/л нитрата аммония обеспечивает оптимальные условия для быстрого образования клеточных суспензий с высокой плотностью. При недостатке иона аммония существенно снижается темп клеточных делений и уменьшается численность обраэованшихся клеточных популяций (табл. 2). !

При добавлении нитрата аммония к среде в количестве менее 200 мг/л (45 мг/л NH4) положительный эффект по сравнению с оптимальными дозами (200-300 мг/л) значительно снижался, а при введении 400 мг/л эффективность сохранялась на прежнем уровне.

Добавление нитрата аммония к среде

MS, отличающейся высокой концентрацией иона аммония (371 мг/л), неэффективно.

При использовании среды, укаэанной в прототипе, которая характеризуется низким содержанием азота, в частности полным отсутствием иона аммония, а также применение железа в виде цитрата клеточные суспенэии из тканей проростков получить не удалось.

Большое влияние на темпы образования клеточных суспенэий и их плотность окаэынала концентрация сернокислого железа и натриеной соли этилендиаминтетрауксусной кислоты (Ма

ЭДТА). Оптимальные условия для получения суспензионньж клеточных культур были созданы при повышении дозы

FeS04 7!!а0 до 70-100 мг/л и !1а ЭДТА— до 90-130 мг/л (табл. 3) .

При сравнительном испытании ряда ауксинон сходного характера действия была установлена наибольшая эффективность 2,4-Д (табл. 4).

Испытание 2,4-Д в концентрациях

2-10 мг/л показало, что наилучшие результаты получаются при дозах 48 мг/л. Применение 2,4-Д н концентрации ниже 4 мг/л приводило к замедлению образования клеточных суспензий и снижению их жизнеспособности, а использование этого фитогормона в концентрации более 8 мг/л ингибировало клеточные деления. Несмотря на то, что отдельные сельскохозяйственные культуры образуют наиболее плотные клеточные суспенэии при 2 мг/л

2,4-Д, эту концентрацию нельзя рекомендовать для использования в связи с быстрой потерей полученными клеточными суспенэиями способности к размножению.

Положительный эффект был достигнут при использовании н качестве эксплантатов проростков илн нх частей, измельченных до 1-3 мм. Уменьшение размеров эксплантатов до 0,1-0,5 мм приводило к их лизису и отмиранию, а увеличение до 5-7 мм — к преимущественному развитию каллусов, при этом клеточные суспенэии не образовывались или скорость их роста снижалась более чем в 10 раэ.

Клеточные суспензия, полученные предлагаемым способом, были размножены пассированием на среды с уменьшен1380688

Результаты получения клеточных суспензионных культур у важнейших сельскохозяйственных растений предлагаемым способом

Жизнеспособность

Культура

Средняя плотность клеточсуспензионных культур, Х ных суспензий, тыс.клеток/мл

Злаки

31 + 3 87 + 5

130+ 12 90+ 8

58т 7 85+10

62+ 5 89+ 6

Пшеница

Овес

Кукуруза

Кострец

Рис

309 + 31 82 + 13

Бобовые

Клевер

Люцерна

Эспарцет

Горох

Соя ным до указанного в прописях содержания серно-кислого железа и Na ЭДТА.

При субкультивировании в течение 10 циклов выращивания суспензионные клеточные культуры сохраняли высокую жизнеспособность.

Предлагаемый способ позволяет существенно сократить материальные и трудовые затраты, унифицировать и ускорить процесс получения клеточных суспензионных культур по сравнению с прототипом.

Ф о р м у л а и з о б р е т е н и я

Способ получения суспензионных клеточных культур растений, включа1 ющий вычленение эксплантатов и культивирование их на жидкой питательной среде, отличающийся тем, что, с целью ускорения процесса и повышения эффективности способа, в качестве эксплантатов используют фрагменты проростков размером 1

3 мм, а в питательную среду вводят дополнительно железо серно-кислое в количестве 70-100 мг, натриевую соль этилендиаминтетрауксусной кислоты 90-130 мг и 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту в количестве

4-8 мг íà 1 л питатального раствора.

Таблица 1

617+ 30 93+ 4

680 27 92 + 5

524 24 86 + 8

365 34 80 + 12

277 + 29 81 + 10

1380688

11родолжение табл. г j

135 «15 79 х 14

Фасоль

Сложноцветные

121 7 88+ 5

119+ 8 84+ 7

Подсолнечник

Гербера

Пасленовые

127 7 82 + 14

232 «+ 11 78 + 16

Ка р т о 4 ел ь

Табак

Крестоцветные

141+ 13 83т 13

96+ 7 75а15

Рапс

Сурепица

Тыквенные

45 + 5 80 + 8

54 6 77 10

Лрбуз

Тыква

Зонтичные

108 + 6 87 6

Морковь.Таблица 2

Влилние нитрата аммония на среднюю плотность суспензнонньи клеточных культур (тыс.клеток/мл) и скорость их образования.

Среда SH реда

MS °

NH4Nо, с добавлением NH NO мг/л с ходсходая ая!

00 200 . 300 4

300 400

151 147 140 5

315 385

492 540, 543 302

Время культквирования ° сут

136 271 388 423 412 . 158

80 136 145 139 133

290 404 447 435 409

374 508 520 507 530!

380688

Т а б л и ц а 3

Влияние серно-кислого железа и Иа ЭДТА на среднюю плотность клеточных суспензионных культур

Концентрация, мг/среды

5 10 15

130 240

250 300

28

70

110 390 480

140 420 520

70

130 400 490

130

100

90 350 410

150

115

Таблица 4

Влияние ауксинов на образование суспензионных клеточных культур

Фитогормоны (акусины):

Концентрация, мг/л

5 10

2,4-Дихлорфенок-., 1 сиуксусная кислота (2,4-Д) 2

140

10

2,4,5-Трихлорфе- 1 ноксиуксусная кислота (2,4,5-Т) 2

26 109

130 284

FeS0» 7Н О Na< ЭДТА

Средняя плотность клеточных культур,тыс.клеток/мл, через, сут

Средняя плотность клеточных суспензионных культур, тыс.клеток/мп, через, сут

34 120

45 150

220 430

420 520 !

55 370

0 14

1380688

Продолжение табл. 4

КонФитогормоны (акусины) 10 15

14

10

120

4-Амино-3,5,6трпхлорпиколино14

16

71 вая кислота (ЛТХП) 168

10

240

225

140

10

Составитель С.Куваева

Редактор M.Ïåòðoâà Техред М.Дидык Корректор А. Зимокосов

Заказ 1129/4

Тираж 661 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, )K-35, Раушская наб., д.4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г.ужгород, ул.Проектная,4

1-Нафтилуксусная кислота (НУК) центрация, мг/л

Средняя плотность клеточных суспензионных культур, тыс.клеток/мл, через, сут

170 310

99 215